四、操作步骤
1．样品消化
称取适量样品0.1~2g（固体），移入干燥的消化管中，加入0.2g 硫酸铜，3g 硫酸钾及20mL 硫酸，轻轻摇匀后进行消化。待消化液呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。停火冷却后，将消化液移入100mL 容量瓶中，用水定容至2．碱化蒸馏向接收瓶内加入10mL2%硼酸及2 滴混合指示剂并使冷凝管下端插入液面下，吸取10.0mL 样品消化稀释液注入凯氏定氮仪的反应室中，用10mL 蒸馏水冲洗进样入口，再加10mL50%氢氧化钠溶液，打开水蒸汽发生器与反应室之间的夹子，蒸汽通入反应室使氨气被蒸发出来，并通过冷凝管而进入接收瓶内，以第一滴馏液滴下开始计时，蒸馏5min，取下接收瓶。松开水蒸汽发生器瓶上的夹子，迅速夹紧水蒸汽发生器和反应室之间的夹子，将废液排出。
3．滴定
用微量酸式滴定管，以0.05mol/L 盐酸标准溶液进行滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。
4．空白试验
同时取10.0mL 空白消化稀释液同上操作。
5．盐酸标定
精密称取约0.08g 在270~300℃干燥（或在500~600℃干燥40~50min）至恒重的无水碳酸钠，加入50mL 水使之溶解，加10 滴溴甲酚绿一甲基红混合指示剂，用配制的盐酸标准液滴定至溶液由绿色变为紫红色，煮沸2min，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。
盐酸标准溶液的摩尔浓度计算：C = m /（V1－V2）× 0.0530
式中：
C 盐酸标准溶液的摩尔浓度（mol/L）；
m 无水碳酸钠的质量（g）；
V1 样品滴定消耗盐酸标准溶液的体积（mL）；
V2 空白滴定消耗盐酸标准溶液的体积（mL）；
0.0530——每毫摩尔无水碳酸钠的克数。100mL。取与处理样品相同量的硫酸铜，硫酸钾，硫酸按同一方法作试剂空白试验。
五、结果计算
式中：
X 样品中蛋白质的含量（%）；
V1 样品消耗盐酸标准液的体积（mL）；
V2 空白实验消耗盐酸标准液的体积（mL）；
C 盐酸标准溶液通过标定后的摩尔浓度（mol/L）；
0.014 每毫升盐酸标准液相当于氮的克数；
m 样品质量（g）；
F 氮换算为蛋白质的系数为6.25.
六、附 注
1．蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏中途不得停火断汽，否则发生倒吸。加碱要足量（反应室液体呈深蓝色或褐色）并且碱液不能污染冷凝管及接收瓶。
2．蒸馏是否完全，可用精密pH 试纸测试冷凝管出口的冷凝液是否呈碱性来确定。
七、思考题
1．总氮测定时，消化至关重要，样品消化时注意事项有哪些？
2．样品脂肪较多时，应如何处理？
参考答案
1．样品开始炭化时易产生暴沸现象，这时要减小火力，勿使炭化物质上升到消化管上部。待消化液均匀沸腾后，再加大火力。如果消化液不易澄清透明时，可将消化烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2~3mL，再加热，直至消化液黄色消失呈淡蓝色透明为止。
2．如果样品脂肪较多时，可适当增加硫酸量，促使硫酸与氨作用形成硫酸铵。否则因硫酸过少，过多的硫酸钾将与硫酸作用形成硫酸氢钾，而阻止硫酸与氨作用，导致氨损失而使测定结果偏低。
