（4）向上清液中加入等体积酚/氯仿，震荡混匀，10 000r/min 离心2 min，将上清液转移至新的离心管中。
（5）向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置2 min。离心5 min，倒去上清乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
（6）加1mL 70%乙醇，震荡并离心，倒去上清液，真空抽干，待用。
3．质粒DNA 的酶解
将自提质粒加入20μL 的 TE 缓冲液，使 DNA 完全溶解。取清洁、干燥、灭菌的具塞离心管编号用微量加样器按表1 所示将各种试剂分别加入每个小离心管内。
表1 DNA酶切加样表
* 补无菌双蒸水至20μL，依实际情况做相应调整
加样后，小心混匀，置于37℃水浴中，酶解2~3h，反应终止后，各酶切样品于冰箱中贮存备用。
4．DNA 琼脂糖凝胶电泳
（1）琼脂糖凝胶的制备：称取0.6g 琼脂糖，置于三角瓶中，加入50 mL TBE 缓冲液，经沸水浴加热全部融化后，取出摇匀，此为1.2%的琼脂糖凝胶。
（2）胶板的制备：取橡皮膏（宽约1cm）将有机玻璃板的边缘封好，水平放置，将样品槽板垂直立在玻璃板表面。将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心倒入凝胶液，使胶液缓慢展开，直到在整个玻璃板表面形成均匀的胶层，室温下静置30 min，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。用滴管将样品槽内注满TBE缓冲液以防止干裂，制备好胶板后立即取下橡皮膏，将胶板放在电泳槽中使用。
（3）加样：用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。每次加完一个样品，要用蒸馏水反复洗净微量加样器，以防止相互污染。
5． 电泳
加完样品后的凝胶板，立即通电。样品进胶前，应使电流控制在20mA，样品进胶后电压控制在60~80V，电流为40~50 mA。当指示前沿移动至距离胶板1~2cm 处，停止电泳。
6． 染色
将电泳后的胶板在EB 染色液中进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA 条带。
五、结果与观察
在波长为254nm 的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板。DNA 存在处显示出红色的荧光条带。
六、思考题
1．染色体DNA 与质粒DNA 分离的主要依据是什么？
2．EB 染料有哪些特点？在使用时应注意些什么？
参考答案
1． 纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质粒DNA分子大得多，而且染色体DNA被断裂成线状分子，但质粒DNA 为共价闭环结构，当加热或用酸、碱处理DNA 溶液时，线状染色体DNA 容易发生变性，共价闭环的质粒DNA 在冷却和回到中性pH 时即恢复其天然构象。
2．EB 染料的全名是3,8-二氨基-5-乙基-6 苯基菲啶溴盐。EB 能插入DNA 分子中碱基对之间，导致EB 与DNA 结合，DNA 所吸收的260nm 的紫外光传递给EB，或者结合的EB 本身在300nm 和360nm 吸收的射线均在可见光谱的红橙区，以560 nm 波长发射出来。EB 染料有许多优点，如染色操作简便、快速，室温下染色15~20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng 或更少的DNA 即可检出。
但应特别注意的是，EB 是诱变剂，配制和使用EB 染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB 的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。
