一、 目的
掌握质粒的小量快速提取法；了解质粒酶切鉴定原理。
二、 原理
质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子。大小在1~200kb 之间，具有双链闭合环状结构的DNA 分子。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。他可独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞的某些表型。
所有分离质粒DNA 的方法都包括3 个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA 则留在上清液中。用酒精沉淀洗涤，可得到质粒DNA。质粒DNA 分子量一般在10⁶~10⁷ 道尔顿范围内。在细胞内，共价闭环DNA（covalentlyclosed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（open
circular DNA, 简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA 形式存在，它比其开环和线状DNA 的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA 在电泳凝胶中呈现3 条区带。限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA 分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA 的双链，形成一定长度和顺序DNA 片段。如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是：
EcoRⅠ：G↓AATTC
HindⅢ：A↓AGCTT
G，A 等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。
三、 实验材料、主要仪器和试剂
1．主要仪器
（1）塑料离心管1.5mL×30
（2）塑料离心管架×1
（3）微量加样器10μL、100μL、1 000μL 各一支
（4）常用玻璃仪器及滴管等
（5）台式高速离心机（20 000r/min）
（6）电泳仪
（7）电泳槽
（8）样品槽模板
2．材料
大肠杆菌DH5α
3．试剂
（1）pH8.0 G.E.T 缓冲液（50mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl）；用前加溶菌酶4mg/mL。
（2）pH 4.8 乙酸钾溶液（60mL 5mol/L KAc，11.5mL 冰乙酸，28.5mL H₂O）
（3）酚/氯仿（1∶1，V/V）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使其浓
度为0.1%，并用Tris-HCl 缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇（24∶1，V/V）。
（4）pH 8.0 TE 缓冲液：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，其中含有RNA 酶（RNase）20μg/mL。
（5）TBE 缓冲液：称取Tris10.88g、硼酸5.52g 和EDTA 0.72g，用蒸馏水溶解后，定容至200mL，用前稀释10 倍。
（6）EB 染色液：称取5g 溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB），溶于蒸馏水中并定容到10mL，避光保存。临用前，用电泳缓冲液稀释1 000 倍，使其最终浓度达到0.5μg/mL。
四、操作步骤
1．培养细菌
将带有质粒的大肠杆菌DH5α接种在LB 琼脂培养基上，37℃培养24~48h。
2．从细菌中快速提取制备质粒DNA
（1）用3~5 根牙签挑取平板培养基上的菌落，放入1.5mL 小离心管中，或取液体培养菌液1.5 mL 置小离心管中，10 000r/min 离心1min 去掉上清液。加入150μL 的G.E.T.缓冲液，充分混匀，在室温下放置10min。
（2）加入200μL 新配置的0.2mol/L NaOH，1%SDS。加盖，颠倒2 ~ 3 次使之混匀。冰上放置5 min。
（3）加150μL 冷却的乙酸钾溶液，加盖后颠倒数次混匀，冰上放置15 min。10 000r/min离心5 min，上清液倒入另一离心管中。

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