双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。
【材料】
生理盐水1%琼脂管（每管约4ml）
载玻片
打孔器及打孔模板
微量加样器及塑料吸头
抗体及抗原1、2、3、4、5、6。
湿盒
【方法】
1．将已溶化的1%琼脂盐水管放56~60℃水浴箱中平衡温度备用。
2．将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂3.5~4ml，使成厚度约1.5mm琼脂板。
3．凝固后，将打孔模板置于琼脂板下，然后用打孔器打孔，根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型。本次实验采用三角型，即每一个三角型的三个孔为一组。（因本次实验所制备的琼脂板均以载玻片为底板故根据其大小只能采用三角型同时每一琼脂板也只能制成两组。否则，如采用方阵型或梅花型则因琼脂板边缘琼脂厚度不够而使周边各孔所加抗原或抗体量不足或溢出，如制成三角型三组，因各孔相距过近相互渗透扩散而难于正确判定结果）。
4．用微量加样器加抗体各10μl。各组所余两孔各按抗原1、2为一组，3、4为二组，5、6为三组，分别各加入10μl。注意每加一样品均需更换加样器塑料吸头，以防止交叉现象影响实验结果。
5．作好记录，放湿盒中，置37℃温箱，24小时后观察结果。
【结果】
说明：
（1）融合性沉淀弧，说明两孔中抗原相同，为同一性反应。
（2）两沉淀线独自形成并形成交叉，说明两孔中的抗原完全不同，为非同一性反应。
（3）融合性沉淀弧出现支线，或同时有另一条或两条沉淀线，说明两孔中抗原有相同部分又有不同部分，此为部分同一性反应。
