(二)免疫球蛋白的鉴定:
1.血清学方法鉴定:
经提纯的免疫球蛋白可做为抗原,用已知的抗血清进行鉴定,方法可选用琼脂单向扩散法、双向扩散法及免疫电泳等方法。
2.聚丙稀酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE):
聚丙稀酰胺凝胶电泳是利用丙稀酰胺(Acrylamide,Acr.)与双丙稀酰胺(N,N―methylene Bisacrylamide,Bis)在催化剂作用下聚合成大分子凝胶后再进行电泳,因此它兼有分子筛效应与电泳效应。各种蛋白质分子通过凝胶孔时所受阻力程度与其大小、形状有密切关系,因此可分开泳动率很相近而分子大小形状不同的蛋白质。可用于鉴定和分离高分子物质。
(1) 材料:样品(提纯的免疫球蛋白),丙稀酰胺,加速剂(TEMED或DMPN),催化剂(过硫酸铵),Tris(三羟基氨基甲烷),HCl,甘氨酸,20%蔗糖,0.5%溴酚兰,0.05%氨基黑染液,5%醋酸,园盘电泳仪。
(2) 方法:
①配制聚丙稀酰胺凝胶:
贮存配制:
A液(pH8.9 Tris―HCl缓冲液):48ml 1N的HCl加36.6g Tris,再加蒸馏水至100ml。
B液:28g丙稀酰胺加0.735g双丙稀酰胺,再加蒸馏水至100ml。
工作液配制:
甲液:1份A液,2份B液,1份蒸馏水混匀。
乙液:0.4g过硫酸铵加蒸馏水100ml。
临用前以甲液1份+乙液1份+DMPN或TEMED(配8ml工作液时加2滴)。
②配制电极缓冲液(pH8.3的Tris―甘氨酸缓冲液):
Tris6.0g加甘氨酸28.8g,加蒸馏水至1,000ml。临用时将此液再稀释10倍。
③聚胶:在电泳园盘上装入凝胶管,下口用玻璃珠堵塞,加入配制好的凝胶工作液。凝胶面上加0.5mm水层,凝聚后再吸去水层并取下玻璃珠。
④加样:加入血清或提纯的免疫球蛋白约10μl,样品上加1滴20%蔗糖(防止样品与电极缓冲液对流)。为便于示踪,样品内可加0.5%溴酚兰5μ做指示剂。最后在样品管和电泳槽中加满电极缓冲液。
⑤电泳:每管3mA,电压220V,泳动3小时。
⑥染色:从管中取出凝胶,浸于0.05%氨基黑染色液中染色约半小时,再放入5%醋酸中脱色至无余色脱下为止(约需1天)。
(3) 结果分析:可以通过标准品进行定位。
(三)保存:
经鉴定合格后,将免疫血清中加1%的硫柳汞或5%的叠氮钠,使其最后浓度分别为0.01%,或0.05%,然后将免疫血清分装1~2ml小瓶(或安瓶)内,放―20℃冷冻,可保存二年,如有条件可将免疫血清冷冻干燥保存。
(二)血清学反应(Serological reaction)
血清学反应是免疫学实验中最基本的实验,它可以利用已知抗原检测未知的抗体(如病人的血清标本),也可以用已知的抗体诊断未知的抗原(如自病人分离的病原微生物),因此在临床免疫学诊断中具有十分重要的地位。目前,血清学试验虽已有很多发展 , 但仍归属于以下三类,既:凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。
1. 凝集反应(Agglutination reaction)
以凝集反应原理为基础的实验中,除最基本的试管凝集实验及玻片凝集实验外,尚有乳胶颗粒间接凝集抑制试验、间接血细胞凝集试验及葡萄球菌A蛋白(SPA)协同凝集试验等。由于乳胶颗粒间接凝集抑制试验―妊娠试验已为酶联免疫吸附实验所替代,而间接血细胞凝集试验及SPA协同凝集试验又多用于微生物学诊断实验范畴,故以上三试验均不重复介绍。


