4. 2 多糖类杂质的去除
多糖的污染是提取植物DNA 时常遇到的另一棘手的问题[11] 。植物组织中往往富含多糖, 而多糖的许多理化性质与DNA 很相似,因此很难将它们分开。经典的CsCl 梯度离心能有效的除去植物中多糖,但梯度离心设备昂贵,操作不便且DNA 得率很低。近年国内外有一些去除多糖的相关报道,Dellaporta 等认为加入高浓度的 KAc 有利于除去多糖[12] ;Fang 等认为在1. 0～2. 5 mol/ L NaCl 的高盐TE 中,用无水乙醇沉淀DNA 能除去多糖[13] ; Sue Porebski 等在沉淀粗提DNA 时,将NaCl 的浓度提高至2. 5 mol/ L 以除去多糖[14] ;Candelario 等通过调节材料的取样时期、使用量, 在氯仿处理后加含2 %CTAB 的分离缓冲液, 及延长离心时间等方法来有效去除仙人掌植物的多糖[15] ;徐志祥等将DNA 沉淀重悬于30 %乙醇中4 ℃放置过夜,离心, 上清加乙醇至80 %重新沉淀DNA ,能去除多糖和其他杂质[16] ;陈大明等利用活细胞中由于细胞区室化多酚类以及其他杂质与DNA 相互隔离的特性,在裂解细胞前用不含 CTAB 的提取缓冲液(0. 14 mol/ L 葡萄糖、3 %可溶性PVP、10 mmol/ Lβ2巯基乙醇) 去除细胞质中大多数生化成分,同时有效地防止多酚类物质被氧化,从而达到排除多酚类等杂质干扰的目的[17] ;程运江等先用水饱、乙醚和1. 2～1. 5 mol/ L Na2 Cl 溶液将大部分多糖去除, 再用2 倍乙醇沉淀DNA 可大大提高效率[18] 。An Michiels 等用生长2～4 月的幼苗转移到暗室暗化处理4 周的黄化叶提取DNA 有效地防止多糖污染,同时发现在25 ℃异丙醇过夜沉淀DNA 能减少杂质污染且大大提高产率[19] 。关于提取DNA 中蛋白质、糖类、多酚等各种杂质对分子生物学后续试验的影响,马小军等和文晓鹏等认为在一定范围内DNA 样品中蛋白质含量的高低, 可能不是影响PCR 扩增的重要因素, 去除RNA 后尚未纯化的DNA 作为模板进行RAPD 扩增也能得到和纯化后一致的条带。但是, 用EcoRI 和HindIII 检测表明, 未纯化的DNA 不能用于酶切[20 - 21] 。目前检测DNA 的纯度最常用的方法是测定DNA 在230、260、280 nm的吸收值, 通过计算OD 260/ OD 280 来评价DNA 的纯度, 通常认为OD 260/ OD 280 在1. 8～2. 0 表明 DNA 的纯度较好。尽管这种方法用得很普遍,但并不可靠, 因为核酸在260 nm处的吸收很强,只有存在高水平蛋白质杂质时才会引起这2 个波长下吸收值的比值发生明显改变[22] 。检测DNA 纯度最佳的办法是采用EcoRI、HindIII 等限制性核酸内切酶对DNA 进行酶切消化,只有能被酶切完全并可用作PCR 模板的基因组DNA ,才能证明其纯度高,所含蛋白质、多糖类等杂质少,才能进一步用于AFLP、RFLP、Southern 杂交等分子生物学的研究。
5 展望
快速、经济地从植物样品中提取高产量、高纯度的基因组DNA 已成为植物分子生物学研究的首要问题。今后,基因组DNA 提取方法研究的发展将趋于用非有机溶剂提取法替代传统的有机溶剂提取;实现一步提取法,省去繁琐的提取和多次离心过程,更适于批量操作;利用物理吸附法,操作简便、提取效率高、对基因组DNA 没有损伤作用,适宜于自动化操作;提取过程自动化,把基因组DNA 的提取与其他分子生物学技术(毛细细管电脉,PCR ,基因芯片技术等) 结合起来,实现从样品处理到基因分析过程的全部自动化操作。
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