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常用的临床免疫学检测技术
作者:佚名 来源:生物秀 时间:2008-5-20

    国内大多数医院实验室诊断PNH仍限于溶血实验,此法并非特异性诊断实验,而通过流式细胞仪及免疫荧光技术检测外周血红细胞膜、白细胞膜及网织红细胞膜上CD55和CD59的表达,将是诊断PNH的重要手段。

    (2)免疫性血小板疾病和中性粒细胞减少症的临床诊断  原发性血小板减少性紫癜和中粒细胞减少症患者血液中存在着抗血小板抗体和抗白细胞抗体,流式细胞仪可以用于这些抗体的分析。

    6、血小板膜表面受体测定在血栓性疾病方面的应用
    目前认为,与血小板功能有关的血小板膜受体有Ⅱb、Ⅲa、IIb/Ⅲa复合物、Ⅱb、vWF、 GMP140 、Fg等。其检测方法不尽相同,有SDS-PAGE法、交叉免疫电泳法等等,这些方法难于检出含量较低的膜受体。免疫印记法的灵敏度较高,但标本用量大,操作复杂,膜纯化过程中受体变化大、易丢失,因此临床实验室较少应用。

    放免法则易受其他细胞的干扰或因一个抗原分子结合多个抗体而测定结果不准确。以FCM测定血小板膜受体,是分析血小板功能方法学上的一大进步,该方法测定准确、快速、特异,操作方便,重复性好,标本用量少,非常适合于临床常规检测。

    7、在贫血中的应用
     网织红细胞分析是临床上监测贫血的一个重要指标。人工镜检仍普遍用于网织红细胞计数。但许多研究证明,镜检法计数精确性差,受人为因素干扰大,而且用肉眼无法准确判断网织红细胞的成熟程度(RNA含量),随着流式细胞仪及一系列自动化网织细胞分析的出现,不但能快速、准确地计数网织红细胞(RET%)(1分钟内测定10000个细胞以上),而且可提供新的评价红细胞生成活性的参数-网织红细胞成熟指数(RMI)。

    (三)流式细胞仪在细胞增殖和肿瘤病理研究中的应用
    1、细胞周期和DNA倍体分析
       FCM进行DNA分析的原理在生物细胞中,DNA含量是比较恒定的参量,DNA含量随着细胞增殖周期各时相发生变化。Go /G1期细胞的DNA含量为二倍体DNA含量,是较恒定的2C值;S期细胞的DNA含量较二倍体高但低于四倍体,即从2C值~4C值;G2/M期细胞的DNA含量为四倍体含量,是较恒定的4C值。

    2、碘化丙啶(PI)的荧光标记法 
         对于标记DNA的荧光探针目前最常用的是PI,PI是属于插入性荧光染料,可选择性地定量嵌入核酸双螺旋的碱基之间,其荧光发射为橙红色,如果使用氩离子激光488nm激发,PI发射光谱波长在610-620nm范围,PI的优点是荧光发射强度大,其CV值较小,PI的最佳浓度为50µg/ml, PI不能通过活细胞膜进入细胞内与核酸结合,因此可以用于鉴别死活细胞。

    在染色活细胞时,要采用膜打孔方法,把染料引入细胞内,或将细胞固定。另外,PI可与双链RNA结合,故在染色细胞DNA时首先要用RNA酶处理细胞,以排除RNA对定量DNA含量精度的干扰。

    (四)FCM在细胞凋亡研究中的应用
    1、DNA含量分析由于凋亡细胞DNA被降解后,小分子DNA可通过细胞膜逃逸于细胞外,另外凋亡小体也可带走部分DNA,造成了凋亡细胞的DNA含量非倍体性下降,由此可导致对DNA染料的着色能力下了,表现在G1期峰前出现亚二倍体峰,称为亚G1期峰(凋亡峰)。

    2、细胞膜结构的改变在凋亡细胞的形态学改变中,胞浆膜的改变是最早出现的。凋亡的早期阶段可检测到快速、持续的细胞内钙离子升高,大量的钙离子激活谷氨酰胺转移酶,谷氨酰胺转移酶的活化使胞浆膜磷脂的对称性丧失,导致膜内侧磷脂酰丝胺酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层,从而可被PS特异的Annexin-V探针所标记。Annexin-V为35-36KD的钙离子依赖性磷脂复合蛋白,对PS有极强的附着力,并可被FITC、PE、Biotin等荧光物质标记。

    此方法简单、可靠,由于凋亡时细胞膜的改变大大早于DNA的改变,因此Annexin-V染色是检测早期凋亡细胞的敏感方法。但是该方法无法区分凋亡晚期细胞和坏死细胞,因此必须用活细胞。

    3、DNA断裂点标记DNA裂解是细胞凋亡的最后一步,由于核酸内切酶活化,使得核小体内DNA断裂为50-300kb的片断,继而裂解为200bp的DNA碎片。由于碎片的产生暴露出多个3’-OH末端,利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT),能够催化外源性的dUTP或Brd- UTP连接到DNA碎片的3’-OH末端。

    以荧光物质标记dUTP或抗BrdUTP单抗,就可以用FCM检测到UTPB或rd-UTP的数量,从而间接检测到凋亡过程中DNA碎片上所带的3’-OH末端。此方法灵敏度高、特异性好,目前已被广泛采用。检测3'-OH末端的同时还可以与PI双染色,进一步检测到细胞DNA含量。

    (五)其他应用
    1、染色体流式核型分析
    用流式细胞仪分析和分选人类染色体是分子生物学和遗传学研究中一个非常有效的方法,通过此法,研究者可进行核型分析和鉴定,分离纯化某号染色体并构建染色体特异性DNA文库,这在遗传病基因定位、基因克隆方面发挥着重要的作用。

    传统的核型分析采用分带技术显示出不同染色体的特征信息,然后再显微照相、放大、剪接、组型,这种方法不但费时而且无法排除人为主观因素的干扰。目前仪器自动分型的方法有两种:一是采用图像技术的静态方法;二是采用流式细胞术。后者不但能分析染色体,还能纯化得到克隆实验所要求的染色体,这是其他任何技术都无法完成的。

    2、流式染色体分析的临床意义:目前,染色体分析已广泛应用于产前诊断、遗传性疾病、放射性损伤、肿瘤细胞染色体分析等多方面的研究。但传统的染色体显带技术分辨率低,人为因素干扰大,而流式核型分析分辩率高,可以分辨显微镜下观察不到的变异,且每分钟分析的染色体数目远远大于人工显微镜计数。

    3、细胞内钙离子(Ca2+)的测定
    Ca2+ 作为细胞信使,参与许多的生命过程,测量活细胞内Ca2+ ,在细胞生物学中有广泛的意义。作为Ca2+ 的荧光探针,Fluo-3有着自身的特性,信噪比大,激发波长(506nm)适于流式细胞仪的氩离子激光器在488nm激发,所以越来越多地用于Ca2+ 的检测。

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