（二）ELISA反应的类型：
1、双抗体夹心法
检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
（1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合抗体及杂质。
（2）加受检标本，与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
（3）加酶标抗体。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时，固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
（4）加底物显色。夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
在临床检验中，此法适用于检测各种蛋白质等大分子抗原，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）、促绒毛膜性腺激素（HCG）等。双抗体夹心法只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。
2、间接法测抗体
间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
(1) 将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
(2) 加稀释的受检血清。血清中的特异性抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
(3) 加酶标抗免疫球蛋白（酶标抗抗体，一般为酶标抗人IgG )。它与固相复合物中的抗体相结合，从而使该抗体间接地标记上酶。清洗后，固相载体上的酶量与特异性抗体的量相关。
(4) 加底物显色。颜色深度与标本中受检抗体量相关。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。本法的主要缺点为受检标本须经稀释（1:50-1:20）的后才能进行测定，否则血清中高浓度的非特异性IgG和其他干扰物质会引起阴性本底过高，影响结果的判断。
3、双抗原夹心法
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。同属抗体检测，与间接法不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。在间接法不适用时（例如包被抗原中的杂质可与酶标记的抗入IgG反应），可试用此法。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。在临床检验中，抗HBs的ELISA常采用本法。
4、竞争法测抗体
当相应抗原材料中含有与抗入IgG反应的物质，而且不易得到足够的纯化抗原进行包被时，可用此法检测特异性抗体．其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量愈多，结合在固相上的酶标抗体愈少。因此阳性反应呈色较浅于阴性反应。由于抗原的难得，在包被时多采用捕获法，即先包被与抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。
5、竞争法测抗原
小分子抗原和半抗原因缺乏可作夹心的二个或二个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定。竞争法的原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少。因此标本中抗原含量较多的，反应呈色较含量少的为淡。小分子激素，药物等的 ELISA测定多用此法。
6、捕获法测IgM抗体
IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接ELISA一般仅适用于检测IgG抗体。如用酶标记的抗人IgM作为二抗进行间接ELISA测定IgM抗体，标本中同时存在的不同浓度的IgG抗体将与IgM抗体竞争，而使结合在固相抗原上的IGM抗体相应减少。另外标本中如含有类风湿因子、也会产生干扰。因此用一般的间接法测定IgM抗体不能得到准确的结果。
在捕获法中，用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继加酶标记针对抗原的特异性抗体，再与底物作用，呈色即与标本中的特异性IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。
二、酶免疫测定的发展和应用
（一）ABC-ELISA
ABC为亲和素(avidin)、生物素（biotin）、复合物（complex）的略语。亲和素是一种糖蛋白，可以和4个生物素分子紧密结合。可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。生物素与亲和素的结合，虽非属免疫反应，但特异性强，亲和力大，二者一经结合就极为稳定。
由于一个亲和素分子有四个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的酶分子，形成一种类似晶格的复合体。因此如把生物素亲和素系统与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的灵敏度。
ABC-ELISA可分为酶标记亲和素-生物素（labeled avidinbiotin,LAB）法和桥连亲和素-生物素（bridge avidin biotin, BRAB）法二种。前者将酶标记在亲和素分子上；后者通过BNHS分别制成酶-生物素和抗体-生物素，通过亲和素搭桥将二者结合起来。利用生物素-亲和素系统对荧光免疫技术的敏感度也有明显的放大作用。ABC- ELISA已广泛用于细菌、病毒、寄生虫感染等的诊断中。
（二）酶联免疫电转移印斑法
Burnette于1981年建立酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunolectrotransfer blot, EITB），并称之为西部印斑(Western blot). EITB分三个阶段进行。
第一阶段为SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酞胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）．
第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上。选用低电压（100V）大电流（(1-2A)，通电45分钟转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异抗体和酶标记第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS- PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，在蛋白质化学中应用广泛。EITB不仅用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。
（三）斑点-ELISA
斑点-ELISA (dot - ELISA)的特点是：1以吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体；2底物经酶反应后形成有色沉淀，使固相膜染色。在实验室中斑点-ELISA可按下法进行。在硝酸纤维素膜上打成4*4mm的小格。在每格的中央，加抗原1-2ul，成为一个小点。干燥后将每格剪下分别放人ELISA板孔内，按ELISA方法操作，最后加入能形成不溶性有色沉淀的底物，如在膜上出现染色斑点，即为阳性反应。
（四）酶免疫电泳
常规电泳结合酶免疫反应，可起到微量抗原定位作用。如在甲胎蛋白检测中，将待测血清在醋酸纤维素膜上进行电泳，因甲胎蛋白含量少，位置邻近白蛋白，用一般染色法难于判定。如将电泳后的醋酸纤维素膜与HRP标记的特异性抗甲胎蛋白抗体共同温育，洗涤后加入底物，在甲胎蛋白处即出现显色条带。
电泳结合酶免疫反应的另一种方法，为酶标记抗原对流免疫电泳，用于检测血清中的抗体。方法为将可溶性抗原用酶标记，然后将此酶标抗原与受检血清按常规方法进行对流免疫电泳，最后以底物进行显色，抗原与抗体孔间呈明显的着色沉淀线即为阳性反应，表示有特异性抗体存在。常规对流电泳法中不可见的沉淀带，经酶免疫着色后有时清晰可辨，从而提高阳性检出率。
