三 PCR技术
PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。
Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖；
（二）基本要素
1 Taq DNA聚合酶：
水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶
①5’→3’DNA聚合酶活性；
②无3’→5’外切酶活性，
35轮0.25%错配，与原始模板有差别；
最适聚合酶 温度72℃，选择72℃延伸
半衰期：92.5℃ 130min
95℃ 40min
97.5℃ 5—6min
变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性
pfu DNA 聚合酶
耐热
5’→3’DNA聚合酶活性
3’→5’外切酶活性
精确度：pfu >Taq
但pfu扩增效率通常比Taq酶略差
文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果
2 .引物
人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，
Tm值要相近，每条10-50pmol /100l
◆设计原则：
（1）靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同
3'下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同
正链5'————— 3' ——上游Primer
——下游Primer 负链 3'————— 5'
例如：
IL-3正链
5'GCTCCATGACCCAG----------- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3'
负链3'CGCTAGAAAACTCAGGTT 5'
上游~： 与其相同
下游~： 先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3'
所以负链Primer：5'-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3'
（2）Primer 本身不要出现内部互补序列
形成loop环，内部二级结构
如： GGGTCGATTCCTACCCATGC
（3）注意减少Primer间互补序列
导致2个Primer形成dimer
一般不要超过3个互补bp
如：CCCATGC ATGGAGTC
: : : : : : : :
GGGTCTA TCAGTAAGC
（4）Primer 5’未端可修饰、突变:
修饰
如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果
突变：
AGCTCCATGACCCAG
5'CGCTCCATGACCCAG 3'
注意：绝不可以在3'端进行上述改造
∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸
（5）primer 5’端增加碱基
①内切酶识别点：
（G）GAATTC GCTCCATGACCCAG
↑保护bp
对PCR产物cloning有很大好处
便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同
EcoRI 1 BglII 2-3
XbaI 2-3 HindⅢ >3
BamHI 2-3 PstI >4
XhoI >4 NotI >10
如果所用保护bp数量不合适→影响内切酶消化→影响下步克隆
∵未切开，连接不上
②ATG起始密码
③TAA、TAG、TGA终止密码
如：
可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外区。
3.模板：
可选：DNA
mRNA→逆转录→cDNA
DNA包括： 质粒 噬菌体 染色体DNA
较小 较大 ①目的gene是单拷贝
变性较易 变性较难 ②非常大，变性难
模板用量
Plasmid:lng
Chromosome:300-500ng
注意：
防止交叉污染
