概述
1962年Shimomure等首先从维多利亚水母(Aequorea Victoria)中分离出了GFP (Green-Fluorescent Protein) 。
1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构。
1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河。
之后很快发现GFP能在多种异源细胞中表达，GFP在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮。
GFP的发光特性
GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。
GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。
尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测
GFP的性质
GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。
GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。
GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。
但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。
由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
Comparison of GFP and Luciferase Imaging
|
Method |
Minimum cells imageable in vitro |
Minimum cells imageable in vivo |
Need for substrate? |
Need for anesthesia? |
Method of visualization |
Multicolor imaging |
|
GFP |
1 |
1 |
No |
No |
Direct Imaging |
Yes |
|
Luciferase |
300 |
3000 |
Yes |
Yes |
Photon counting (pseudo-color) |
No |
GFP在生物医学中的应用
GFP作为新型报告基因用于转基因研究
GFP融合蛋白用于研究蛋白质定位、移动及相互作用
研究活细胞分子变化过程
发育分子机理研究
示踪病原菌
临床检验
在肿瘤研究中的应用
GFP在肿瘤研究中的应用
GFP在肿瘤发病机制研究中的应用
GFP在肿瘤发生发展研究中的应用
GFP在检测肿瘤血管形成方面的应用
FP在抗肿瘤药物筛选中的应用
GFP在肿瘤发病机制研究中的应用
GFP 是一个分子量较小的蛋白,易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。GFP 与目的基因融合,将目的基因标记为绿色,即可定量分析目的基因的表达水平,显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化,为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。
在肿瘤的形成过程中,增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体。若肿瘤细胞凋亡占优势,肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡。肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控。用GFP 转染肿瘤细胞凋亡相关基因,并与正常组织进行比较,若过表达,则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因;反之,为促进肿瘤细胞凋亡的基因。
肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现,其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。利用GFP 的示踪特性,研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系,即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。
