7．低相对分子质量标准蛋白质（上海产），开封后溶于200ml 重蒸水，加200ul2 倍样品缓冲液（还原缓冲液），分装20 小管，-20℃ 保存。临用前沸水浴3-5min。其相对分子质量如下：
标准蛋白质 Mr
兔磷酸化酶B 97400
牛血清白蛋白 66 200
兔肌动蛋白 43 000
牛碳酸酐酶 31 000
胰蛋白酶抑制剂 20 100
鸡蛋清溶菌酶 14400
8．质量浓度为10％过硫酸按：此溶液需临用前配制。
9. 1.5％琼脂：1.5g 琼脂粉加l00ml 重蒸水，加热至沸腾，未凝固前使用。
10．染色液：0.25g 考马斯亮蓝R250 ，加人91ml50 ％甲醇，9 ml 冰醋酸。
11．脱色液：50ml 甲醇，75ml 冰醋酸与875ml 重蒸水混合。
12. 待测相对分子质量的样品。
五、操作
1．将垂直平板电泳槽装好，用1.5％琼脂趁热灌注于电泳槽平板玻璃的底部，以防漏。
2．分离胶的选择和配制方法
(l）按照蛋白质不同的相对分子质量选用不同浓度的分离胶。
蛋白质相对分子质量的范围 分离胶的浓度
<104 20％-30%
1×104 - 4×104 15％-20%
4×104 - 1×105 10％-15%
1×105 - 5×105 5％-10%
>5×105 2％-5%
（2）不同分离胶的配制方法
3．分离胶的灌制
根据待测蛋白质样品的相对分子质量选择合适的分离胶浓度，本实验选用12 ％的分离胶。在15ml 试管中依次加入重蒸水 3. 35ml、1.5mol/lTris - HCI ( pH8. 8 ）缓冲液2.5ml、10 % SDS 0.lml 、凝胶贮备液0.8ml、10％过硫酸铵25ul 和TEMED5ul，由于加入TEMED 后凝胶就开始聚合，所以应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃板之间灌注，留出梳齿的齿高加 Icm 的空间以便灌注浓缩胶。用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约 30-60min ，分离胶则聚合，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水，尽可能去干净。
4．浓缩胶的配制和灌制
一般采用 5％的浓缩胶，配制方法：重蒸水 2.92ml、0.5mol/LTris-HCI 缓冲液（pH6.8 )1.25ml、10%SDS0.05rnl、凝胶贮备液4.0ml、10%过硫酸铵25ul、TEMED5ul，在试管中混匀，灌注在分离胶上。小心插人梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合（约30min）。
5．样品的制备
（1）标准蛋白质样品的制备
取出一管预先分装好的20ul 低相对分子质量标准蛋白质，放人沸水浴中加热3-5min，取出冷至室温。
（2）待测蛋白质样品的制备
a . 10ulVEGF（约含 5ug VEGF）加10ul 2 倍还原缓冲液。
b . 10ul VEJ（约含5ug VEGF ) ，加10ul 2 倍非还原缓冲液。
以上a、b 两管均同标准蛋白质样品一样，在沸水浴中加热 3-5min ，取出冷至室温。
6．电泳
（1）待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳齿，用电极缓冲液洗涤加样孔（梳孔）数次，然后将电泳槽注满电极缓冲液。
（2）用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样。
（3）接上电泳仪，上电极接电源的负极，下电极接电源的正极。打开电泳仪电源开关，调节电流至 20-30mA 并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约Icm 时，停止电泳。
7．染色与脱色
小心将胶取出，置于一大培养皿中，在溴酚蓝条带的中心插一细钢丝作为标志。加染色液染色lh ，倾出染色液，加人脱色液，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰。
8．相对分子质量的计算
用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及钢丝距分离胶顶端的距离，按下式计算相对迁移率：
相对迁移率=样品迁移距离/染料迁移距离
以标准蛋白质Mr 的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。
