VI 凝胶层析法分离纯化蛋白质
一、目的
了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
二、原理
凝胶层析也称凝胶过滤、凝胶过滤层析、分子排阻层析和分子筛层析。凝胶是具有一定孔径的网状结构物质，凝胶层析是一种分子筛效应，主要用于分离分子大小不同的生物大分子以及测定其相对分子质量。相对分子质量小的物质可通过凝胶网孔进人凝胶颗粒的内部，而相对分子质量大的物质不能进人凝胶内部，被排阻在凝胶颗粒之外，随着洗脱的进行，相对分子质量小的物质由于进人凝胶内部，不断地从一个网孔穿到另一个网孔，这样“绕道”而移动，走的路程长，下来得慢（迁移速度慢），而相对分子质量大的物质因不能进人凝胶内部即随洗脱液从凝胶颗粒之间的空隙挤落下来，走的路程短，下来得快（迁移速度映），这样就可达到分离的目的。
目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶（商品名sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名Bio-GelP）、琼脂糖凝胶（商品名因生产厂家而不同，如瑞典的Sepharose ，美国的Bio-Ge1 A)，其中最常用的是sephadex。sephadex 有各种不同型号，用于分离相对分子质量大小不同的物质。
三、实验器材
1．层析柱1cm×90cm
2．恒流泵
3．紫外检测仪
4．部分收集器
5．记录仪
6．试管等普通玻璃器皿
四、实验试剂
1．待分离样品：胰岛素、牛血清白蛋白等
2．葡聚糖凝胶Sephadex G-75
3．蓝色葡聚糖2000
4．洗脱液：0.1lmol/l pH6.8 磷酸缓冲液
五、操作
1．凝胶的处理
Sephadex G-75 干粉经蒸馏水室温充分溶胀24h ，或沸水浴中3h ，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和排除凝胶内部的气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。凝胶颗粒大小要求均匀，使流速稳定。凝胶充分溶胀后用倾泌法将不易沉下的较细颗粒除去。
将溶胀后的凝胶抽干，用10 倍体积的洗脱液处理约lh ，搅拌后继续用倾泌法除去悬浮的较细颗粒。
2．装柱
将层析柱垂直装好，关闭出口，加人洗脱液约Icm 高。将处理好的凝胶用等体积洗脱液搅成浆状，自柱顶部沿管内壁缓缓加人柱中，待底部凝胶沉积约Icm 高时，再打开出口，继续加人凝胶浆，至凝胶沉积至一定高度（约70cm ) 即可。装柱要求连续，均匀，无气泡，无“纹路”。
3．平衡
将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱人口相连，用2 一3 倍床体积的洗脱液平衡，流速为0.5ml / min 。平衡好后在凝胶表面放一片滤纸，以防加样时凝胶被冲起。
柱装好和平衡后可用蓝色葡聚糖2 000 检查层析行为，在层析柱内加lml ( 2mg / ml ）蓝色葡聚糖2 000 ，然后用洗脱液进行洗脱（流0.5ml／rnin ) ，若色带狭窄并均匀下降，说明装柱良好，然后再用2 倍床体积的洗脱液平衡。
4．加样与洗脱
将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将1 司样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，用少量洗脱液洗柱内壁2 次，加洗脱液至液层4cm 左右，按上恒流泵，调好流速（0.5ml / rn in ) ，开始洗脱。上样的体积，分析用量一般为床体积的1％一2% ，制备用量一般为床体积的20％一30％。
5．收集与测定
用部分收集器收集洗脱液，每管4ml。紫外检测仪280nm 处检测，用记录仪或将检测信号输人色谱工作站系统，绘制洗脱曲线。
6．凝胶柱的处理
一般凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱（2 一3 倍床体积）即可，若凝胶有颜色或比较脏，需用0.5mol/l NaOH 一0.5mol/l NaCI 洗涤，再用蒸馏水洗。冬季一般放2 个月无长霉情况，但在夏季如不用，则要加0.02％的叠氮钠防腐。
VII SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量
一、目的
了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子质量。
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。SDS 是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一个因素，就可根据标准蛋白质的相对分子质量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可以用圆盘电泳，也可以用垂直平板电泳，本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。
三、实验器材
1．直流稳压电泳仪。
2．垂直平板电泳槽。
3．移液器（1.0ml 、200ul 、20ul ）。
4．微量注射器（20ul ）。
5．烧杯、试管、滴管、直尺等
四、实验试荆
1．凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr ) 29.2g，亚甲基双丙烯酞胺（Bis ) 0.8g, 加重蒸水至100ml 。外包锡纸，4℃ 冰箱保存，30 天以内使用。
2．分离胶缓冲液：1.5mol/lTris-HCI , pH8.8。
18.15 Tris（三经甲基氨基甲烷），加约80ml 重蒸水，用lmol/lHCI 调pH 到8.8，用重蒸水稀释至最终体积为l00ml, 4℃冰箱保存。
3．浓缩胶缓冲液：0.5mol/lTris-HCI , pH6.8。
6gTris，加约60ml 重蒸水，用lmol/lHCI 调pH 至6.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml,4℃冰箱保存。
4．10%SDS，室温保存。
5．两类样品缓冲液：
(l) 2 倍还原缓冲液
0.5mol/LTris-HCI,pH6.8 2.5ml
甘油 2.0ml
质量浓度10%SDS 4.0ml
质量浓度0.1％溴酚蓝 0.5ml
β-巯基乙醇 1.0ml
总体积 10ml
(2) 2 倍非还原缓冲液
重蒸水 1.0ml
0.5mol/LTris-HCI,pH6.8 2.5ml
甘油 2.0ml
质量浓度10% SDS 4.0ml
质量浓度0.1％溴酚蓝 0.5ml
总体积 10ml
6．电极缓冲液，pH8.3 。
Tris 3g，甘氨酸14.4g,SDS 1.0g，加重蒸水至1000ml , 4℃ 冰箱保存。
