（二）器材
1.直流稳压电泳仪。
2.垂直平板电泳槽。
3.移液器（1.0ml、200μl、20μl）。
4. 微量注射器（20μl）。
3.烧杯、试管、滴管、直尺。
四、操作步骤
1、将垂直平板电泳槽装好，不同的电泳槽安装的方法不同，按说明书进行。
2、分离胶的选择和配置方法
（1）按照蛋白质不同的相对分子量选用不同浓度的分离胶。
|
蛋白质的相对分子量的范围 |
分离胶的浓度 |
|
＜104 |
20%～30% |
|
1×104 |
15%～20% |
|
4×104 |
10%～15% |
|
1×105～5×105 |
5%～10% |
|
＞5×105 |
2%～5% |
（2）不同分离胶的配制方法
|
分离胶的浓度 |
20% |
15% |
12% |
10% |
7.5% |
|
重蒸水/ml |
0.75 |
2.35 |
3.35 |
4.05 |
4.85 |
|
1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)/ml |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
|
质量浓度为10%SDS/ml |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
凝胶贮备液(Acr/Bis)/ml |
6.6 |
5.0 |
4.0 |
3.3 |
2.5 |
|
质量浓度为10%过硫酸铵/μl |
50 |
50 |
50 |
50 |
50 |
|
TEMED/μl |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
|
总体积/ml |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
3、 分离胶的灌制
根据待测蛋白质样品的相对分子量选择合适的分离胶浓度，本实验选用血管内皮生长因子（VEGF）为待测相对分子质量的样品（常用的VEGF的相对分子质量约为44000，还原后为22000。），用12%的分离胶。在15ml试管中依次加入重蒸水3.35ml、1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)缓冲液2.5ml10%SDS0.1ml、凝胶贮备液4.0 ml、 10%过硫酸铵50μl和TEMED 5μl，由于加入TEMED后凝胶就开始聚合，所以应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，留出梳齿的齿高加1cm的空间以便灌注浓缩胶。用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约30～60min，分离胶则聚合，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水，尽可能去干净。
4、浓缩胶的配制和灌制
一般采用5%的浓缩胶，配制方法：重蒸水2.92 ml、0.5mol/L Tris-HCl缓冲液（pH6.8）1.25ml、10%SDS0.05ml、凝胶贮备液（Acr/Bis）10%过硫酸铵25μl、TENED5μl，在试管中混匀，灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合（约30min）。
5、样品的制备
（1）标准蛋白样品的制备
取出一管预先分装好的20 μl低相对分子质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热3～5min，取出冷至室温。
（2）待测样品的制备
a.10μlVEGF(5μgVEGF)加10μl 2倍还原缓冲液。
b.10μlVEGF(5μgVEGF)加10μl 2倍非还原缓冲液。
以上a、b两管均同标准蛋白质样品一样，在沸水浴中加热3～5min，取出冷至室温。
6、 电泳
（1）待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳齿，用电极缓冲液洗涤加样孔（梳孔）数次，然后将电泳槽注满电极缓冲液。
（2）用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样。
（3）接上电泳仪，上电极接电源的负极，下电极接电源的正极。打开电泳仪电源开关，调节电流至20～30mA并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。
全文下载： http://www.ebioe.com/down/html/down_321.htm
7、 染色与脱色
小心将胶取出，置于一大培养皿中，在溴酚蓝条带的中心插一细钢丝作为标志。加染色液染色1h，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次脱色掖，直至背景清晰。
8、相对分子量的计算
用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及钢丝距分离胶顶端的距离，按下式计算相对迁移率：
相对迁移率=样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）
以标准蛋白质Mr的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。
