化学发光底物发光信号发光信号当然越强，持续的时间越长，背景低灵敏度高越好，化学发光法由于仅在酶和底物都存在的时候才会发光，不同于生色反应般形成不溶的产物于膜上累积，所以特别适合同一张膜对不同的目标蛋白分别进行多次检测。目前最高检测灵敏度已经达到低飞克（Femto）级别而成为安全且灵敏度最高的WB检测方法。
碱性磷酸酶AP也是常用的显色交联酶，很早就被用于检测系统——包括固定化抗原（WB）检测和核酸检测。其优点是底物显色更稳定，不像HRP那样需要新鲜配制的H2O2一类的不稳定成分，作为试剂盒可以保存时间更长。但是做过AP实验的经常会遇到膜上显色背景偏高的问题，分子克隆III解释说由于在我们常用的封闭剂：脱脂奶粉和牛血清白蛋白BSA中富含AP，这样当然显色背景会高。所以分子克隆III推荐的AP适用封闭剂是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmo lEDTA 65度加热一小时确保AP失活后再用于封闭。一些研究的样本自身也含有较高水平的碱性磷酸酶，虽然实验上很容易实现抑制内源AP影响，但实际上容易被忽略。AP显色底物生成的产物主要是蓝紫色，容易拍照。现在由于HRP系的化学发光底物已经不断改进而使得灵敏度不断提高，化学发光显色上HRP和AP不相上下，但是生色反应来说，AP显色的灵敏度还是比一般的HRP显色底物要高。AP也有这两种常用的检测方法的不同底物，常用的是BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3’-Indolyphosphate p-Toluidine Salt) ，NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride)和INT。
还有一些比较特殊的底物，比如Pierce公司的Fast Red，是为Western印迹，点印迹和免疫组化过程中检测AP而专门设计，这种底物产生的是亮红色沉淀，经过优化，灵敏度高，其中最有趣之处在于其双染色的好处：由于这种亮红色沉淀可以与不溶的HRP底物沉淀无论是NC还是尼龙膜上都能形成醒目的对比，因此可以进行两次显色，检测不同的蛋白。
AP的化学发光底物可快速产生强信号，因此可以获得非常漂亮灵敏的WB结果，而且不需要像生色底物那样等待半小时才能看结果。例如Invitrogen的WesternBreeze检测灵敏度达到Femto飞克级别的AP化学发光法检测试剂盒，而且发光持续时间长达5天。而且优化后的背景极低。Pierce公司的产品—Lumi-Phos Wb灵敏度可以达到低pg级，而且可以使用尼龙膜。Lumi-Phos Wb的发光持续时间是8个小时。
四：免疫印迹技术的注意事项：
1． 免疫印迹技术所测定的只是目的蛋白的相对含量。因此不能确定一种细胞含有多少目的蛋白，只能确定该蛋白存在与否及其它条件下与其他细胞相比蛋白的含量是高还是低。
2． 比较一种目的蛋白在不同细胞或者同一细胞不同条件下的相对含量时，各样平的总蛋白量必须相等。
3． 选用合适的SDS-PAGE胶浓度，使目的蛋白可以得到较好的分辨。
4． 开始电泳和转移欠，一定要确认电极的正负极接头是否正确。
5． 在免疫检测中，要注意封闭非特异性结合位点。
6． 抗体反应在封口塑料袋内进行，一定要取出袋内的所有旗袍，否则会导致抗体结合不均匀。
7． 操作要轻柔，带手套，不要再转移抹上造成任何刮痕。在整个操作中，转移膜要始终在液体中，不能干燥。
