3．聚偏二氟乙烯（PVDF）膜
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜作为基质的转印膜由Millipore公司在1985年首先推出。与硝酸纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性能（Pluskal,etal.,1986)。市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜结合量是100-200μg/cm2（而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍！）。在艾滋病毒（HIV）血清学检验中直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，PVDF膜具有更好的截留总HIV抗原能力并提高抗体检测糖基化被膜抗原的性能。而且PVDF膜最大的优点是具有更好的机械强度和化学耐受性。这使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；而且单个凝胶的泳道复本可用于多种目的，如考马斯亮蓝染色后切出条带并进行N-末端测序、蛋白消化，肽分离，内部测序和免疫检测。特别是需要做N端蛋白测序，能经得起多次清洗。所以PVDF也是要做蛋白测序的唯一选择。此外，一些强疏水蛋白用PVDF膜效果会更好一些。PVDF膜适用的检测方法也不少，如化学发光、常规显色、同位素和标准染色，但不适合荧光。PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡。PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，对小分子蛋白有较好的拦截吸附，背景可能会比前者稍高。常见的公司有Millipore ，Bio-Rad，Pierce，Pall Life Science，Invitrogen，Whatman等。
三．酶免疫定位
1. 封闭
Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。脱脂奶是最常用的经济配方但是用这种封闭剂由于里面可能有痕量的生物素和碱性磷酸酶，可能造成背景污染而不适合生物素—亲和素的检测方法，脱脂奶也不适合碱性磷酸酶检测（AP）方法。如果采用碱性磷酸酶检测系统，封闭剂最好用6%酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/L EDTA磷酸缓冲盐加热65度1小时确保碱性磷酸酶失活（可以加0.05%叠氮化钠，新鲜最好）。现在HRP是越来越普遍的选择。但是叠氮钠(NaN3)对辣根过氮化物酶(HRP)有灭活作用，如果用HRP检测系统则封闭液不要加叠氮化钠为好。如果选用AP作为显色方法，封闭时就要选择Tris缓冲体系。
2．抗体的的选择
一抗一般只要是说明书上注明mb就可以用于westen blot /单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，因此多抗虽然不如单抗专一性高，但是更容易得到结果。一般一抗最好选择源于兔或者小鼠，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而选择范围更大通用性也更强。除了无标记的一抗，还有生物素等各种标记一抗和用荧光标记的一抗直接检测而降低背景和非特异结合，但是同时也少了二抗的级联放大信号扩增，信号也会比较弱。所以需要选择荧光信号特别明亮的标记。一抗的稀释度通常需要预实验摸条件，可以根据说明书上建议的WB稀释度附近做2—3个梯度，如果是用化学发光法检测，由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些。
二级试剂的作用是信号扩增，选择是根据一抗的标记形式而决定的，对于无标记的一抗，可以选择对应一抗来源种属的标记二抗，或者更便宜的标记蛋白A（来自金黄葡萄球菌Protein A可以高度亲和来自人，兔，豚鼠的IgG，但对大鼠、山羊和鸡的IgG亲和力弱）。不过，二抗是更可靠的选择——除了要选择对应一抗的来源种属，也要根据你准备采用的检测方法选择合适的标记。
3．标记的选择
Western Blot一般都选择酶促作为检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法，如化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen。前者灵敏度很高,灵敏度已经达到pg级别，甚至还有 Femto级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。最常用的有辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，属于过氧化物酶POD类）和碱性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外还有还有葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、β半乳糖苷酶β-Galactosidase。
HRP 辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物2大类。HRP的生色底物显色有DAB，4-CN ，CN/DAB，AEC和TMB等（而得到可溶性产物的底物如OPD，ABTS等则适用于ELISA）中，与化学发光法中的酶促基团发光不同，底物显色主要是利用底物在有HRP和过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测WB的结果。3'3'二氨基联苯胺（DAB）是最常用的底物，可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录，而且有毒。由于DAB显色是褐色，不如4-CN反差大容易拍照，有的厂家还推出了DAB+4-CN混合底物，结合了DAB灵敏度高和4-CN背景低，易成像的优点，能获得很好的黑色沉淀成像。用金属离子增强信号的DBA显色试剂灵敏度可以高达20pg。TMB的signal-to-noise信噪比高，成分安全，特别合适于灵敏度要求高的WB，但是也要避免由于灵敏度高而引起的高背景，因此可以相应的延长封闭的时间和注意洗涤的次数；ACE各方面性质与DAB相似，但灵敏度要比DAB差一点。
