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电子显微镜免疫细胞化学技术
作者:佚名 来源:生物秀 时间:2008-4-25

    (1)包埋剂的配制:商品提供的Lowicrys包埋剂由三个部分组成:单体(Monomer),交联剂(Crosslinker)和引发剂(Initator)。调整单体和交联剂的比例,增加交联剂的量,组织块的硬度增加。中等硬度的组织块,其配制比例如下:
    K4M:单体 17.30g
    交联剂 2.70g
    引发剂 0.10g
    K11M:单体 19.00g
    交联剂 1.00g
    引发剂 0.10g
    作者的经验,可用微量注射器加针头抽取后,注入棕色的玻璃容器避光,用玻棒轻搅3~5min或用一小管通入液氮气泡以搅拌之。勿过分搅拌,以防氧的气泡进入包埋剂中。
    (2)生物样品处理程序(Lemanski 等1985)
    ①动物麻醉取材,以多聚甲醛—赖氨酸—过碘酸钠在9℃固定2h。
    ②磷酸缓冲液含7%蔗糖,pH7.2,冲洗过夜,0℃
    0.1mol/L ③磷酸缓冲液,pH7.2,冲洗,0℃
    ④脱水:65%乙醇,1h ,0℃
    80%乙醇,2h,-35℃
    Lowicryl K4M:80%乙醇=1:11h -35℃
    Lowicryl K4M:80%乙醇=2:11h -35℃
    100% Lowicryl K4M 1h -35℃
    100% Lowicryl K4M 过夜-35℃
    ⑤包埋:新鲜K4M置于胶囊内,将组织移入,在-30℃~-40℃以紫外线灯波长360nm 2× 15W(Ladd Research Industries Burlington VT)相距30~40cm照射24h使之聚合。如为100W灯泡,照射距离应大于85cm。聚合后的胶囊移至室温在紫外线下继续照射2~3天,可增加其硬度,便于切片。
    (3)免疫染色
    ①切片(厚50~70nm)贴在金网或覆有碳膜的镍网上。所有下列步骤在室温、湿盒内进行。所有溶液需经微孔滤纸(0.25~0.45μm)滤过。
    ②正常羊血清30min。
    ③第一抗血清(PBS稀释),372h℃。
    ④可用烧杯法(或塑料壶喷洗法),以镊夹镍网在第一烧杯中洗荡30min,然后在第二烧杯中洗荡1h 。
    ⑤正常羊血清30min。
    ⑥第二抗血清(胶金标记抗体)以正常羊血清稀释为1:1,以镍网置于血清滴上孵育1h。
    ⑦冲洗如④。
    ⑧覆于2%OSO4水溶液上,30min。
    ⑨冲洗如④。
    ⑩干燥后在电镜下观察。
    (4)Lowicryl K4M快速包埋染色法(Altman等1984)
    ①包埋剂的配制:单 体13g
    交联剂2g
    引发剂75mg
    ②生物样品处理:除了聚合这一步骤外,下列所有步骤都在20℃进行。
    1)组织用3%戊二醛—3%多聚甲醛磷酸缓冲液,pH7.4,在20℃固定1~2h。用磷酸缓冲液清洗后进行脱水。
    2)脱水:在50%、75%和90%的双甲基甲酰胺(Dimethylformamde,DMF)内系列脱水,每步10min。
    3)浸透:Lowicryl K4M:DMF=1:2 10min
    Lowicryl K4M:DMF=1:1 15min
    100% Lowicryl K4M 20min
    100% Lowicryl K4M 25min
    4)包埋与聚合:组织移入装满K4M的胶囊中,以紫外线灯照射聚合(紫外线灯条件同上),灯和组织距离10cm,4℃照射45min,组织块在室温进行超薄切片(切片时水槽内水面应略低以防浸湿组织块的切面)。
    5)以覆有碳膜的镍网捞取切片。
    6)免疫染色。

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