一、实验目的
1、学习分离和纯化菌株的方法；
2、学习营养口服液的制作方法及过程；
3、初步了解食品药品生产时的管理规定和技术标准。
二、实验原理
双歧杆菌、乳酸杆菌和乳酸球菌等对人体有明显有营养保健作用，是微生态试剂的重要生产菌株。双歧杆菌是一种厌氧菌和微好氧菌株，它对生存环境的要求非常苛刻，易受氧、水分、光线、保护基质等条件的影响。微好氧菌株经过驯化，能承受一定氧压，既有利于生产，又能促进正常菌群生长和繁殖。在西红柿和豆粕煮汁中等中含有小分子蛋白、双歧杆菌生长因子和低聚糖等物质，能选择性增殖双歧杆菌。乳酸杆菌和乳酸球菌产酸快，从而为双歧杆菌提供较低的pH值环境，对它的生长繁殖有促进作用，因此选择乳酸杆菌和乳酸球菌作辅助发酵菌株。
与此同时双歧杆菌代谢后会产生醋酸及乳酸，使培养液呈酸性，虽能抑制有害菌的生殖，但如果pH值过分降低也使菌体其自身受到酸性的影响，因此在含活菌的活性营养口服液中大多添加磷酸盐等缓冲物质，防止pH过分偏低，延长产品中活菌的保持期并保持其保健作用。
三、材料与方法
(一)、实验材料
1、菌种：双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌由本实验室筛选，经省级权威部门鉴定符合生产和临床使用标准。
2、培养基：
2.1、改良TJA培养基（培养双歧杆菌用）：番茄汁50mL；酵母浸出物5g；肉膏lOg；乳糖20g；葡萄糖2g；K2HPO4 2g；Tween80 1g；醋酸钠2.5g；琼脂15g。
2.2、BL培养基（培养乳酸菌用）：番茄汁400mL；蛋白陈15g；酵母浸膏6g；肝浸液45 mL；葡萄糖20g；可溶性淀粉0.5g； NaCl5g；Tween80 3ml；L-Cys 0.5 g；蒸馏水1 000mL；pH7.2。
2.3、去脂TJA培养基：在改良TJA培养基配方的基础上减去琼脂。
2.4、发酵培养基(生产发酵液)：番茄汁1 ml；酵母浸出物1g；乳糖1g；葡萄糖1g；K2HPO4 0.1g；Tween80 0.1 ml；3%豆粕浸汁100 ml。灭菌温度在115℃，时间20 min。
3、青春型双歧杆菌、乳酸杆菌和乳酸球菌的发酵菌种：试管斜面—→转种50 mL试管—→250mL三角瓶—→测定菌量、酸度和pH值。
液体接种量为3%，摇床振荡培养。
(二)、实验方法
1、菌株活化及发酵剂制作
(1)、倒平板培养基：将改良TJA培养基完全融化并冷却至45℃左右倒平板，冷凝待用。
(2)、分离纯化及活化: 用接种环分别在双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌斜面上挑取少许菌株作平板划线分离。分离后，放37℃下培养以获得单菌落。
(3)、观察菌落特征：经2-3天培养，待菌落长成后，应仔细观察并区别不同类型的菌，注意是否有污染。
青春型双歧杆菌在培养基平板表面常呈现的形态菌落特征: 大小为2-3mm, 菌落中央呈隆起状，边缘整齐，半透明状，有浓郁的醋酸味，染色镜检为短杆状。
乳酸菌在BL培养基平板表面常呈现三种形态特征的菌落: ①扁平型菌落:大小为2-3mm,边缘不整齐，很薄，近似透明状，染色镜检为杆状；②半球状隆起菌落:大小为1-2mm,隆起成半球状，高约0.5mm，边缘整齐且四周可见酪蛋白水解透明圈，染色镜检为链球状；③礼帽形突起菌落:大小为1-2mm，边缘基本整齐，菌落中央呈隆起状，四周较薄，也有酪蛋白透明圈，染色镜检也呈链球状。
(4)、挑取少许具有上述菌落特征和菌株，分别接入装有50ml去脂TJA培养基的试管中，37℃下培养至出现混浊时停止作发酵剂用，如果需用量大可改用发酵罐培养。
2、实验流程及注意事项:
2.1、实验流程
辅助原料 发酵剂
↓ ↓
豆粕煮汁—→调配—→灌装—→高压灭菌—→混合接种—→发酵—→成品
2.2、注意事项
2.2.1、煮汁时一定要控制在90--100℃，时间为1h，不时的搅拌，以免糊化。煮汁一定要细过滤。
2.2.2、双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌的比例为：3:1:1，总接种量为3%。
2.2.3、培养温度控制在37℃，当培养液出现混浊沉淀时，表明此时活菌数很高且大量产酸(此时pH值约4.0)，即可终止发酵。
2.2.4、选择优良的发酵剂是产品是否具有保健作用的关键，也是产品能否长期保存期的关键。
2.2.5、辅助原料按发酵培养基(生产发酵液)配方配制，现配现用以防污染；在发酵及传代中应避免杂菌污染。
2.2.6、实际生产时应按国家标准或行业和企业标准组织生产。
四、实验结果记录
将双歧杆菌口服液混菌发酵液发酵结果记录于下表中。
|
沉淀情况 |
活菌总数 |
pH 值 |
口感 |
口服初步感觉 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
六、思考题
1、在制备保健口服液时，应具备那些条件？
2、在制备保健口服液时，应注意那些因素?
