一．质粒酶切及线性化

1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。

2）线性化质粒

使用80μl酶切体系

9KSF2质粒                   70μl

内切酶（SacI， SalI， BglⅡ）     2μl

10 x buffer        8μl

3）酶切3－16小时，一般3小时即可；

二．乙醇回收酶切质粒

1）2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC（PH 5.2），混匀，沉淀DNA；

2）－20⁰C数个小时（>2小时），13,200rpm离心10～20分钟，吸弃上清；

3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸取）；

4）37℃烘干水分和残留乙醇；

5）用20μl ddH₂O重溶；

6）1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量；

三．电转化

1．准备感受态细胞

1）5ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，30⁰C，摇菌24 hours；

2）100ml YPD，接种百分之一，同时留1ml空白YPD，30⁰C ，250rpm，7～8hours，直到OD₆₀₀＝1.3～1.5；

3）菌液转入500ml离心管，JA14，1500g，4⁰C离心5 min，弃上清；

4）100ml冰水重悬，同上离心，弃上清；

5）80～90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清；

6）20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清；

7）约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，4⁰C备用，剩下的感受态细胞可以保存在－70⁰C冰箱大约3周。

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