1924 年Maximow 又把Carrel 的悬滴培养法改良为双盖片培养，使之更易于传代和减少污染。Carrel（1923）又设计以用卡氏瓶培养，扩大了组织的生存空间。自悬滴培养问世后的30 年中，以Harrison 和Carrel 为首的科学家们，用这些方法对各种组织在体外生长期共存工的规律和细胞形态进行了深入的研究，发表了大量论文，为组织培养的进一步发展奠定了巩固的基础。
（二）组织培养的发展
在悬滴培养法的基础上，从50 年代起，组织培养进入了一个更加迅速发展的阶段。相继有很多学者，从改进培养操作技术方法、培养容器和培养液三个方面，作了很多革新。在卡氏瓶原理的启示了，出现了用试管培养。以后人们又设计出多种类型的培养瓶。从40 年代开始，大多数培养工作都过渡到用瓶子培养。培养基由天然动物血浆改进为应用人工合成培养基（或称限定培养基）；促细胞生长物质从胎汁改用动物血清。与此
同时，培养技术方法的革新进展也非常迅速。Dulbecco（1957）等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了单层（细胞）培养（Single Layer Culture）。单层培养法的出现，对组织培养的发展起了很大的推动作用。此后单层培养便成了组织培养普遍应用的技术。用单层培养法得以建立了很多细胞系（ Cell Line）。1948 年Sanford 创建了单细胞分离培养法，应用这一技术可以建立遗传性状相同的克隆细胞株（Clone 或Cell Strain）。根据研究工作的特殊需要，1951 年Pomerat 设计了灌流小室，使细胞生活在不断更新的培养液中，便于做显微摄电影和细胞代谢等研究。（生物秀-专心做生物 www.bbioo.com）
（三）现代组织培养
从50 年代末起，组织培养技术的应用进入了一个繁盛的阶段。生物科学和技术科学相互渗透、遗传学和生物化学相互结合的结果，出现了分子遗传学、分子生物学、细胞工程等新兴科学。这些新科学的形成和发展都与组织培养有密切关系。当前组织培养技术已广泛用于生物学和医学研究各个领域。反之通过应用又促进了组织培养技术的发展。如出现了用各种理化措施诱发遗传缺欠细胞株、应用细胞杂交瘤技术制备单克隆抗
体、用培养细胞检测环境中可疑致癌物、癌基因转染和细胞转化等各种新技术。当前的组织培养技术不仅是用于研究生命科学理论的重要技术方法，也日益成为生物工程和基因工作的生产手段。如新的中空纤维培养法一次可培养细胞1.2×1011 个，能用于生产多种生物制品。
近年随着科技工业的发展，供细胞培养用的各种条件，如瓶皿、培养基和血清等都已商品化和系列化，使细胞培养工作已成为轻而易举的事情。采用低温冷冻技术可把已建立的多种细胞系和细胞株长期冻存起来。应用冻存技术，在一些发达的国家已建立了统一冻存细胞的细胞库或中心。如美国的ATCC（American Tissue Culture Collection）；HGMR（Human Genetic Mutant Repository），CAR（Cell Aging Repository）等。在英国和日本等也有类似的机构。我国在上海和昆明也建立了小规模储存细胞的实验室。现在全世界储存细胞的数量已难以计算。这些设施为开展组织培养技术和应用培养细胞进行研究工作提供了极大的方便。
（四）我国组织培养的发展
早在30 年代组织培养技术已传入我国，张钧、鲍鉴清教授曾分别在上海和北平倡导过组织培养方法，并进行过一些实验工作。但因当时条件所限，终未能建立起稳定的组织培养研究室。
我国组织培养工作基本上是从50 年代开始的。1952 年鲍鉴清首先在天津建立了组织培养实验室并编写了《组织培养技术》（1954）。在此前后，北京、上海、武汉、长春各地也相继建立了用于医学研究或制备生物制品的组织培养室。我国组织培养应用于微生物研究是比较早的（唐仲章1953，汤飞凡1956，王潜渊1957）。50 年代末HeLa 等细胞系被引入我国（闻仲权1957）。应用组织培养的研究工作时有报道（李昌遵1959，李
何民1959）。60 年代组织培养研究有了更进一步的发展。应用组织培养技术进行各种研究日趋增长。对微生物和病毒研究发展最快（郭辉玉1960，冯慧敏1963）。在其他领域也得到了应用，如肿瘤细胞培养（潘琼婧1960，鄂征1962）、神经细胞培养（鲍璇1962，邵文钊1962，郭婉华1963）、细胞培养染色体显示（吴文1960）、白细胞培养染色体研究（项维、刘祖洞1962、吴文、凌丽华1963、汪安琦、周宪庭、周焕庚1964，王志澄1964）。与此同时细胞培养新技术的引入和改良也不断增多：如羊膜细胞培养技术（曾毅1963，陈乃嘉1964）、培养细胞支原体的污染和排除（萧顺1964）、改良灌流小室培养（陈瑞明，沈鼎武1964），建立细胞系的工作也开展起来（何申、陈泉光1963）。从70 年代起，我国组织培养技术发展更快。它已不再是个别研究室所拥有的技术，已成了医学和生物学研究中普遍应用的手段。近二十年来已建立的人和各种动物肿瘤及其它细胞系，已不可胜数。细胞培养库已初建成，细胞培养用品，培养基、血清、试剂等也已商品化。随市场经济的繁荣、高科技的引入和开展，一次性培养用品也逐渐使用，各种精巧的培养用具不断进入实验室，极大地促进了培养技术的发展。在应用组织培养的研究中，电镜观察技术、放射性核素标记、单细胞显微注射、荧光免疫、电泳技术、细胞融合杂交瘤技术、DNA 转染和细胞转化、分子杂交等各种新技术的使用已较普遍。实验研究已从细胞深入到分子水平。对很多现代课题如细胞转化、癌变机理、单克隆抗体、基因表达和癌基因等，进行着广泛的研究，并取得了可喜的成果，有的已经接近或达到国际水平。
我国组织培养技术仍在继续发展和得到广泛的应用，近几年已召开多次组织培养专题讨论会，对名词统一、技术交流和设备生产等起了很大促进作用。我们相信，随着新技术的应用和设备的改善，我国组织培养必将向更高水平迈进。（生物秀-专心做生物 www.bbioo.com）
（五）对组织培养工作者的要求和工作方法
有人认为，做组织培养工作，只要掌握了培养技术，细胞生长了，就算大功告成，其它似乎无关紧要，这是一种片面的观念。从事组织培养时，不能仅满足技术操作，尤其在设备完善和科技高度发展的今天，掌握培养方法并非难事，更为主要的是：除掌握操作技术之外，尚需明白各种操作的基本道理。二是要有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力；三还要熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性状和与此有关的基本理论知识。这些不仅对科研工作者，对技术辅助人员也是必要的。组织培养是一种程序比较复杂、需要条件多而严格的实验性工作。由于工作环节多，为保证操作上的一致性，避免造成人为的差异，应将所有操作程序如洗刷、配液、消毒等、制定出统一的规范和要求，并在一定时间内保持相对稳定和要求人人遵守。各种用液（培养液、胰蛋白酶、Hanks 液、NaHCO3、抗菌素液），均应由专人负责配制，并保证作到按规程行事：制备浓度精确、灭菌可靠。所有制备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、消毒与否和制备日期。一切培养用品都要有固定的存放地点，其中尤为重要的是：培养用品与非培养用品应来格分开；已消毒与未消毒品应严格分开存放。一切措施都是为了：避免各种杂质混入细胞生存环境、防止微生物感染和细胞“污染”。所谓细胞污染，是指不同细胞之间因操作不严造成的相互混杂，使细胞群体不纯的现象，近年来世界上不少实验室都出现过这种事故，应引起注意。
