【原理】
限制性显示 PCR 技术 (Restriction Display PCR,RD-PCR) 技术的思路是在获得反转录的 cDNA 之后 , 进行 Sau 3AI 酶切? Sau 3AI 识别位点是四个碱基 , 理论上计算平均每 256 个碱基有一个识别位点 , 然后在酶切片段的两端加上通用接头?接头由 15bp 和 21 bp 长的两条互补寡核苷酸单链逐步退火形成 , 接头的一端为 4 个碱基的粘性端 GATC, 恰好与选用的 Sau 3AI 的酶切位点互补 , 另一端为 2 个碱基的粘性端 CA, 可以减少片段自身间的串联?酶切片段加上接头之后 , 用与接头序列配套的限制性引物进行扩增?此时设计的限制性引物是在通用引物的 GATC 端分别加上一个碱基 A ? T ? C ? G( 以下简称 A ? T ? C ? G), 可以使扩增产物有序归类?将引物 A ? T ? C ? G 两两组合 , 共 10 组 , 以接头与 cDNA 酶切片段的连接物为模板 , 进行限制性分组 PCR 反应 , 各组产物在 8% 的变性聚丙烯酰胺凝胶中平行电泳?经 EB 染色后 , 在紫外灯下观察 , 诱导前后的基因差异一目了然?
【试剂与器材】
1. OligdT 15 0.1μmol/L
2.TRIzol 试剂
3.M-MLV
4. 内切酶 Sau 3AI ?
5.dNTP 2.5mmol/L 分别取等体积的 10mol/L 的 dATP,dGTP,dTTP,dCTP 四种混合即成
6.Taq DNA 聚合酶 ( 国产或进口 ): 浓度为 5 U/μl,50μl 反应液中加 1U ?
7. 消毒三蒸水
8.6× 载样 buffer 0.25% 二甲苯青 FF,0.25% 溴酚蓝 ,30% 甘油
9.50×TAE 电泳 Buffer 12.2g Tris,2.85ml 冰醋酸 ,10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0), 加水至 50ml ?
10. 溴化乙锭 (EB) 溶液 10mg/ml( 避光保存 ), 每 100ml 琼脂糖凝胶加 5μl 贮存液 , 即凝胶中 EB 终浓度为 0.5μg/ml, 此试剂为强致癌物 , 要戴手套操作 , 避免污染环境?
11. DNA Marker
12. 各种国产或进口移液器 (10,20,100μl)
13. 消毒的 0.2ml PCR 管 ,10μl,100μl tips
14. 离心机
15.PCR 仪
16. 水平电泳槽和电泳仪
17. 紫外分析仪
【操作步骤】
1. 诱导后细胞的总 RNA 的抽提
将细胞以 4 .0×10 8 /L 密度接种于用 12 孔培养板中 , 每孔 3 mL ,37 ℃? 5%CO 2 孵箱中培养 至细胞贴壁 , 加入长春新碱 , 使之终浓度分别为 0 ? 10 ? 100 μg /mL ?继续培养过夜?按 Trizol 试剂盒说明 , 在预期时间加入 1mL Trizol 试剂 , 置室温 5min, 吸至 1.5mL 经 DEPC 水处理过的 EP 管中 , 置室温 5min, 加氯仿 0.2 mL, 振摇 50s, 置室温 5min, 分层? 4 ℃ ,11 000×g 离心 15min ?仔细取上层水相 , 移至另一 EP 管中 , 加 0.5mL 异丙醇 , 混匀? 置室温 10min,4 ℃ 11 000 × g 离心 10min, 用 DEPC 处理的 75% 乙醇洗涤沉淀 (RNA),4 ℃ ,7 200×g 离心 5min, 弃上清真空干燥后 , 沉淀溶解于 20μL 无 RNase 的水中 , 样品保存于 -20 ℃备用? RNA 样品用紫外分光光度仪测定 A 260 和 A 280 , 计算含量?
2. 从总 RNA 中纯化 mRNA, 参照 mRNA 纯化试剂盒说明 , 步骤如下
• 在 0.4ml 的总 RNA 溶液中加入 50μl 4.5M NaCl,55~60 ℃水浴 10 分钟?
