2.3.1 限制性标记基因组扫描（restriction landmark genomic scanning，RLGS）
Costello等2000年报道的RLGS[46,49]能对整个基因组的甲基化状态进行分析，发现新甲基化基因的方法。这种方法联合使用了限制性内切酶及二维电泳。其过程是：先用甲基化敏感的稀频限制性内切酶NotⅠ消化基因组DNA，甲基化位点保留，标记末端、切割、行一维电泳，随后再用更高频的甲基化不敏感的内切酶切割，行二维电泳，这样甲基化的部分被切割开并在电泳时显带，得到RLGS图谱与正常对照得出缺失条带即为甲基化的可能部位[5]。
这种方法可同时分析不同肿瘤中甲基化模式的异同和寻找肿瘤内DNA甲基化的新靶点，由于新发现的甲基化新靶点的作用尚不清楚，因此其需要后续进一步分析确定，此外，RLGS图谱不能完全确认所缺失的片段是由于甲基化所致还是由于DNA本身缺失所致[5]且结果分析复杂，不易解释。
2.3.2 MBD（Methyl-CpG binding domain column chromatography，甲基化结合区）柱层析法
根据MBD蛋白家族和MeCP2的特性，Masahiko Shiraishi等2004年[50]提出了一种新的方法MBD柱层析法，用于筛选和发现基因组中甲基化的情况。并且比较了MBD和重亚硫酸盐基因组测序法，得出：用MBD柱层析法分析得出的甲基化片段均能用重亚硫酸盐测序法证实[50]。
现已较清楚CpG岛的甲基化在基因沉默中起着重要作用，但其过程中的很多具体环节及机制尚不清楚[51]。如：基因沉默是由启动子区个别位点CpG发生甲基化引起的，还是由全部的CpG发生甲基化而引起的。但研究认为启动子区胞嘧啶甲基化导致基因表达沉默并非是由于甲基基团阻碍了转录因子的结合，而是由于那些能与甲基化区特异性结合的蛋白发挥作用[52,53]而引起的。
现已发现一些能与CpG甲基化位点特异性结合的蛋白，一种是MeCP1，它能够与对称性多位点甲基化CpG位点相结合，另一种是MeCP2，不同于MeCP1的是它能够与单甲基化CpG位点特异结合，且不与半甲基化位点结合。而且报道的MBD1、MBD2、MBD3、MBD4蛋白都与MeCP2有着相同的特性[54,55]。
这种方法是：MBD柱中含有甲基化位点特异性结合蛋白的功能区（Methylation Binding Domain, MBD），能够与甲基化位点特异性结合。该蛋白一端通过连接多个组蛋白与凝胶结合，其另一端的多肽功能区暴露，这样当待测DNA片段通过时，含有甲基化位点的DNA即与MBD多肽牢固结合。在Masahiko Shiraishi等的研究中还发现，甲基化位点的数目是决定MBD柱结合力的最主要因素，而且，甲基化的密度也对其有重要的影响，也就是说，相同长度的DNA片段中甲基化位点密度越高，其结合力就越强[50]。
这种方法的优点是：1.是一种高通量的检测方法；2.可对未知片段进行初筛，选出的含有甲基化的片段进一步检测以发现新的甲基化位点；3.方法快速、简便。缺点是：1.一些DNA片段的特殊构型也可与MBD柱相结合，造成MBD非特异性捕获而引起假阳性（如：EcoRⅡ可与MBD结合）；2.是一种定性而非定量的方法；3. 由于MBD柱中所含多肽的量不完全相同，因此，使用不同的MBD柱或单个柱经多次使用得到的分离产物之间会存在差异[50]。
2.3.3 联合甲基化敏感性限制性内切酶的MBD（Combination of methylated-DNA precipitation and methylation-sensitive restriction enzymes，COMPARE-MS）
Srinivasan Yegnasubramanian 2006年[55]报道了一种新技术COMPARE-MS，该法将MBD柱层析法与MS-RE联用，互补了各自单用的弊处，能够快速、敏感的检测DNA甲基化情况，可用于临床标本检测，作为早期诊断和肿瘤分级的依据[56]。其过程是：用非待测区的内切酶和甲基化敏感的限制性内切酶同时消化DNA片段，随后通过MBD柱捕获，保留了含有甲基化区的片段，最后通过实时PCR扩增定量分析（见图9）。
图9：联合甲基化敏感性限制性内切酶的MBD（COMPARE-MS）示意图。用甲基化以外的位点的内切酶（A酶）与甲基化敏感的内切酶（B酶）联用，则甲基化的DNA链不被切开，非甲基化的切开，再行MBD捕获存在甲基化位点的DNA片段，最后行实时PCR扩增并分析；这就避免了因仅用内切酶（A酶+ B酶）而不用MBD捕获时由于内切酶消化不完全而引起假阳性的问题，同样避免了单用MBD时由于非特异性捕获而引起的假阳性（图9参考引文[55]并略加修改）。
这种方法联合运用了MBD柱层析法及MS-RE法，这就避免了单用MBD引起的非特异性捕获及MS-RE不完全消化引起的假阳性的问题。因此，在快速、简便检测的同时，亦保证了结果的特异性和敏感性。缺点是：需要使用限制性内切酶，因此不同程度地受到内切酶识别位点的限制。
研究甲基化的方法之多，从一个方面说明了甲基化研究难度之大，也从另一个方面说明这些方法都存在着一定的限制。面对具体问题，选择最合适的解决方法就显得尤为重要。首先，根据研究目的选择合适方法：是研究整体水平的甲基化还是特定位点的甲基化，或是要发现全基因组中新的甲基化位点；其次，根据客观条件筛选方法，如：目标的序列是否已知，是定量研究还是定性研究，样本来源及数量如何，是否需要高通量的样本检测方法；最后，全面分析，选取敏感、可靠、经济、简便的方法，以达到理想的效果。随着甲基化研究的不断深入，甲基化分析技术将逐步完善。完善的研究技术将提供强有力的技术支持，从而为表观遗传、胚胎发育、基因印记及肿瘤研究提供一些新的思路。
