2.2.8 甲基化敏感性解链曲线分析（methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA）
Worm等[37]2001年报道的MS-MCA是将DNA经重亚硫酸盐处理与Lightcycle联用检测DNA序列甲基化的方法。荧光素标记双链DNA。这种方法根据检测到的荧光度对应的解链温度，判断分析研究序列中甲基化的情况。在Lightcycle过程中，随着温度升高，逐渐达到DNA双链各解链区域的解链温度Tm，DNA呈区域性逐渐解链，一般说来，序列中CG含量越高，对应的解链温度越高。由于非甲基化的胞嘧啶经重亚硫酸盐处理后变为尿嘧啶、PCR后变为胸腺嘧啶，故其所在序列中的CG含量降低，热稳定性降低，解链温度降低。而甲基化的由于其CG含量高，故其解链温度高。所作结果与标准曲线对照，根据这种特性就可以明确研究序列中CpG的分布区及甲基化程度。（见图6、图7）。
图6：甲基化敏感性解链曲线分析（MS-MCA）示意图。完全非甲基化时，解链温度低(如A)；完全甲基化时，解链温度高（如B）；当等位基因的甲基化的发生集中于一条链或等位基因甲基化嵌合分布时，解链温度改变（如C、D） （图6参考引文 [37]）。
图7：甲基化程度与解链温度关系示意图。p15Ink4b基因的荧光解链曲线，重亚硫酸盐处理HL-60（曲线a， 完全未甲基化的）和MOLT-4（曲线b， 完全甲基化的）这两个细胞系及取自慢性髓性白血病病人骨髓细胞中p15Ink4b的基因（其曲线为c和d，示部分甲基化的）。曲线a、b、c、d的解链峰值分别为81.3℃、88.9℃、84.4℃和86.2℃（图7参考引文 [37]）。
这是一种能对甲基化分布不均匀的DNA样本进行半定量分析的方法。缺点是：1. 它不能够精确检测甲基化的具体位点；2.研究序列的长度不宜过长；3. 该法对低水平的DNA甲基化敏感性低[37]。
2.2.9 荧光法（Methylight）
Eads等[38]2000年报道的荧光法利用实时PCR（Real-time PCR）测定特定位点甲基化的情况。其过程如下：先用重亚硫酸盐处理待测DNA片段。设计一个能与待测位点区互补的探针，探针的5'端连接报告荧光，3'端连接淬灭荧光，随后行实时定量PCR。如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸时，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性会将探针序列上5'端的报告荧光切下，淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制，这样报告荧光发光，测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及水平；同理，若标记的探针未能与DNA杂交，则引物延伸不能跳过未甲基化位点，报告荧光不被切下，不发光。同样方法，也可对引物进行荧光标记，并通过不同标记的组合，检测多个位点的甲基化水平[39]。
高敏感、快速是本方法最显著的特点,它可以在非甲基化等位基因超出10000倍的情况下精确的检测到甲基化的等位基因并定量，而且可以做多样本、多基因位点的快速分析。此外其具备可重复、所需样本量少、不需要[12]电泳分离的特点。它可以为临床标本的分子生物学研究提供可靠的技术支持。缺点是费用高，测定每个位点都要用两端标有荧光素的探针和一对引物，且受较多因素影响。
