2.2.4 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸（methylation-sensitive single nucleotide primer extension，Ms-SnuPE）
Gonzalgo and Jones 1997年提出了结合重亚硫酸盐处理和单核苷酸引物延伸（Kuppuswamy等1991年提出[29]）的Ms-SnuPE方法[30]，用于定量检测已知序列中特异位点的甲基化水平。过程是：先将研究序列用重亚硫酸盐处理，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms-SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms-SnuPE延伸的引物的3’端紧邻待测碱基。同时于2个反应体系中加入等量的Taq酶、引物、同位素标记的dCTP或dTTP。这样，如果待测位点被甲基化，则同位素标记的dCTP会在反应延伸时连于引物末端；若是未被甲基化，则标记的dTTP参与反应。末端延伸产物经电泳分离和放射活性测定后可得出C/T值，即为甲基化与非甲基化的比值，从而分析得到待测片段中CpG位点甲基化情况[5][29]（见图3）。同理也可以用dGTP或dATP。而且，若需研究一条链上不同位点CpG甲基化情况，可通过设计不同的引物在同一反应中完成[12]。
图3: 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸（Ms-SnuPE）示意图。DNA经重亚硫酸盐处理后，以PCR扩增后得到产物作为Ms-SnuPE延伸的模板，于反应体系中入设计好的引物和同位素标记的dCTP或dTTP进行甲基化特异的单核苷酸引物延伸，随后，电泳分离、测定同位素放射活性，确定甲基化水平。
这种方法的优点：1.可以了解特异位点甲基化情况且不受内切酶的限制；2.通过设计的不同引物在同一延伸反应情况可以了解不同位点CpG甲基化的状况；3.可以检测出样本序列中分布不均匀的甲基化位点；4.是一种能够用于定量检测甲基化水平的方法；5.仅需少量的DNA样本，可以用于石蜡包埋样本的测定。缺点是：1.实验步骤略复杂，若要检测多个位点时则需设计多个引物[5]；2.存在放射性污染及重亚硫酸盐处理不完全的问题。
2.2.5 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（combined bisulfite restriction analysis，COBRA）
Xiong and Peter报道了COBRA[31]甲基化检测法。这种方法对标本DNA行重亚硫酸盐处理及PCR扩增，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶变为胸腺嘧啶。随后用限制性内切酶对转化后PCR产物切割的特性以识别原标本DNA的甲基化状况。（见图4）。
图4： 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（COBRA）示意图。重亚硫酸盐处理DNA后行PCR扩增，用限制性内切酶(BstUI）识别转化后序列中的酶切位点，消化产物电泳分离，与完全非甲基化阴性对照组比较，得出序列中特异位点甲基化水平(图4参考引文[31]并略加修改)。
这种方法的优点有：1.方法相对简单，不需预先知道CpG位点及样本序列；2.可以进行甲基化水平的定量研究；3.需要样本量少，可用于石蜡包埋样本的分析[32]。缺点是：1.只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中存在甲基化的可能[5]；2.由于酶和PCR的使用，只能分析一种特定序列[5]。
