2.3.3、DEAE-葡聚糖和polybrene
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene 多聚体复合物和带负电的DNA 分子使得DNA 可以结合在细胞表面。通过使用DMSO 或甘油获得的渗透休克将DNA 复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
2.3.4、机械法
转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA 或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile 将大分子导入细胞。
2.3.5、阳离子脂质体试剂
在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA 的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA 并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb 的质粒会结合2-4 个脂质体。被俘获的DNA 就会被导入培养的细胞。现存对DNA 转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。
2.4、 siRNA 的高转染效率需注意的几点事项
为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点：
1.纯化siRNA 在转染前要确认siRNA 的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA 通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE 胶纯化）。
2.避免RNA 酶污染 微量的RNA 酶将导致siRNA 实验失败。由于实验环境中RNA 酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA 酶污染非常重
要。
3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50 代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。
4.避免使用抗生素 Ambion 公司推荐从细胞种植到转染后72 小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA 转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。
5.选择合适的转染试剂 针对siRNA 制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA 实验的成功至关重要。
6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件 对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA 转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48 小时后统计对照蛋白或mRNA 相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA 将导致细胞毒性以至死亡。7.通过标记siRNA 来优化实验 荧光标记的siRNA 能用来分析siRNA 稳定性和转染效率。标记的siRNA 还可用作siRNA 胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA 的细胞。
3、 制备siRNAs 或者dsRNA 试剂盒的选取
长片断的dsRNA 可以在植物、原生动物、昆虫、线虫中引发基因沉默。要研究这些对象，自己制备长片断的dsRNA 是很容易做到的：通过合适的质粒亚克隆——线性化——体外转录的方法，就可以自己合成dsRNA。目前已经有商品化合成dsRNA 的试剂盒（例如NEB 的HiScribe RNAi Transcription Kit，后文介绍）。但是在哺乳动物细胞中，超过30nt 的dsRNAs 则引起非特异基因沉默。实验表明，在哺乳动物细胞内引发特异的基因沉默最有效的siRNAs 是有19 个碱基互补，两边3'端各有2 个碱基突出（通常是UU，但是目前不清楚UU 对siRNAs 的活性影响有多大） 的一对21-mer 的dsRNAs。由于体外转录利用T7RNA聚合酶进行体外扩增的时候，通常要求序列的首2 个碱基为GG 或者GA 以提高合成效率，但是这两个额外的碱基会大大降低siRNAs 的活性，而且通常体外转录很难高效合成这么小的RNA（通常需在25nt 以上），因而早先哺乳动物细胞的RNAi 实验中用到的siRNAs 是用化学方法合成的，方便，简洁，不受碱基的限制。
可是不管怎么说，化学合成RNA 的费用是相当高的（一个碱基要将近400 元），特别是在哺乳动物细胞中siRNAs 的效率不一，一般一个基因需要设计3—5 对siRNAs 以确定最有效的，这样的费用就高了（就是6—10 条siRNAs（每条21nt），一个基因通常花费不少于20000）。如果需要重复设计，在国内还有时间上的困扰。
现在，多个厂家推出了不同的试剂盒，一个试剂盒可以自行设计合成多个siRNAs，灵活性和可控性都明显提高，不失为一种经济的选择。 例如在体外转录制备siRNA 时，Silencer™ siRNA Construction Kit——Lower Cost & Higher Potency siRNAs Ambion 公司的这个试剂盒是建立在体外转录的基础上的，其专利的设计有效克服了前面提到的难题，原理非常简单：首先合成两段29-mer 的DNA 作为模版（DNA 合成的价格就便宜多了，即
使是全球最著名的DNA 合成供应商Operon，也就是7、8 块钱一个碱基），包括8 个与T7启动子引物3'端匹配的碱基（称为引导序列，leader sequence）和21 个设计的siRNA 序列。将这两个模版和对应的T7 启动子引物分别混合，引物末端和DNA 模版褪火结合，用DNA聚合酶Klenow 大片断补平成为双链DNA 模版，分别用T7 RNA 聚合酶进行体外转录，将产物混合形成dsRNA，新的双链RNA 包含5'端单链的引导序列和中间互补的19 个碱基序列以及3'端两个重复的U（UU）。通过DNA 酶降解模版，同时用单链专一的核酸酶消化5'的引导序列，由于RNase 不能切开U 碱基也不能切双链RNA，所以得到的产物就是我们需要的21-mer 的双链siRNAs——有19 个碱基互补，3'端各有2 个U 突出。通过试剂盒提供的纯化小柱，去除引物、碱基盐和蛋白质等杂质，得到的就是可以立即转化用的siRNAs！
4、 RNAi 存在的若干问题及其前景展望
目前RNAi 机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。siRNA 在哺乳动物细胞中抑制mRNA 表达是有效的，但并不能象果蝇细胞那样完全抑制目的基因的表达，可能是因为生物体是一个复杂的系统，存在多种机制相互作用以调控基因的表达。另外，在哺乳动物中，RNAi 能否成功地抑制基因表达以及抑制的程度还取决于细胞类型。对线虫来说，可以采用注射、浸泡或喂食的方法转入dsRNA，而对哺乳动物来说，寻找高效的方式来转入siRNA 以及快速的方式来筛选RNAi 尚需进一步探索。RNAi 在抗病毒感染中的应用
令人振奋，但能否成功还无法保证。在研究中亦有诸多困难：（1）并不是所有的病毒RNA序列都能比较容易的接近siRNA，被识别、切割。有些病毒靶序列可能隐藏在二级结构下，或者位于高度折叠的区域中，而有些病毒序列可能与蛋白质形成紧密的复合物，阻碍了与siRNA 的识别。（2）病毒的复制过程并不严格，随意性很强，因此往往产生突变的子代。这一特点能够帮助病毒躲避机体的免疫监控和药物的抑制作用，同时也会干扰siRNA 的识别。（3）在siRNA 的导入问题上，同样也面临着技术上的困难。（4）因为细胞内的RNA 酶会降解siRNA，故怎样保证siRNA 的稳定性仍是一个亟需解决的问题。尽管目前对RNAi 的研究还不够深入，RNAi 还不够完善，但这种现象在自然界是普遍存在且有效的，其应用前景十分广阔。它不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学)的发展，还有可能设计出RNAi 芯片，高通量地筛选药物靶基因，逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能，并且它还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学研究等领域，用RNAi 技术来抑制基因的异常表达，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。从发现RNAi 现象至今，只有短短的几年时间，但由于它的重要作用，使其成为生命科学中的研究热点。今后的研究应主要集中于RNAi 作用的机制及如何进一步完善RNAi 技术。
可以相信，RNAi 技术必将为生命科学研究和临床治疗带来新的革命。
