4 固相杂交反应
核酸样品经直接点样或转移到NC膜上并经真空干燥后，即进行杂交反应。在杂交液中，NC膜上变性核酸样品与变性后的标记探针在一定条件下形成杂交双链，然后通过仪器计数或放射自显影判定结果。主要步骤如下。
4.1 预杂交 目的在于消除NC膜对探针的非特异性结合，降低杂交背景。将膜在2×SSC中浸泡2分钟。然后将膜放入盛有预杂交液［6×SSC、0.05×BLOTTO(1×BLOTTO：5%脱脂奶粉。含0.02%叠氮钠)］的杂交管中，于68℃杂交炉中温育1～2hr。
4.2 杂交 将32P标记的双链DNA探针100℃加热5分钟变性，迅速置冰浴中冷却。然后加入预杂交液中混匀，于68℃下杂交16～18小时。
4.3 洗膜 将膜置于大体积2×SSC和0.1%SDS溶液中，于室温下轻轻振摇5分钟，反复2次。又于68℃下用1×SSC和0.1%SDS溶液洗2次，约1～1.5小时。
4.4 放射自显影 将膜在纸巾上凉干，用Saron膜(或冰箱保鲜膜和微波炉用膜)将NC膜做成一夹心包装，用放射性墨水制作的圆点标签在Saron膜上作几个不对称的标记。然后置X光片暗盒中，黑暗下加X光片并加增感屏于-20℃或-70℃下曝光12～16小时。X光底片经显影、定影及冲洗后，利用放射性墨水留下的标记对准NC膜与底片的位置，并与凝胶电泳相片或菌落主板相对比，鉴定阳性核酸带或菌落。
5 分子杂交技术的应用
Southern印迹技术用来检查DNA样品中是否存在有某个特定的基因，特异性非常高，而且还可知道其大小及酶切位点的分布，尽管其操作比较复杂；Northern印迹技术则用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录；点印迹则仅需要一滴液体的样品，就可快捷地检查出其中是否有某个基因，但不能检出基因的大小或重复的程度；菌落原位杂交技术则是基因克隆中，从众多克隆中快速筛选出阳性克隆的最常用的一种方法。
V.Davis(1990)通过病毒基因组的随机引物逆转录制备了IBDV的互补DNA探针。在点印迹中，探针不能区分病毒的疫苗株、田间株以及突变株，但在很严格的条件下也可获得一些特异性。V.Vakharia用按澳大利亚IBDV序列合成的引物以及pGEM系统，制备了已知起始位点的克隆。将从Delaware E株、Grayson株和STC标准毒株获得的RNA从琼脂糖凝胶转移到膜上并用放射性标记的探针检查。只需1小时的放射自显影。但探针不能区分病毒的不同毒株。他用非放射性的地高辛配基系统也获得了好的杂交结果。
Shaohua Zhao等(1990)通过将滑液膜支原体(MS)的WVU1853株克隆到质粒载体pUC18上，并用大肠杆菌转化，构建了MS的基因文库。在点印迹中，4个转化的克隆与放射性磷标记的MS染色体DNA杂交，但与MGS6株的染色体DNA则没有杂交。在Southern印迹中，所有氯化铯纯提的重组质粒克隆都含有2个长度在1.0～2.3kbp的MSDNA片段。用4个重组质粒制备的探针在点印迹中与MS的WVU1853株和9个田间株均可杂交，但与MG及禽支原体其它15个种均无杂交。
M.L.Khan等已制成用来区分MG致病株和疫苗株的DNA探针。对于MG感染的快速诊断，他将株和种特异性的DNA探针直接应用在田间样品的点印迹检测上。将1毫升的样品培养液吸到膜上，然后用探针检查。株特异性的探针具有与MG疫苗株相同的、长度为6kbp的基因序列，它能特异性地检出经MGF株苗免疫的鸡群。种特异性的探针含有1个9kbp的插入片段，它可检测出所有的MG，而与其它的鸟类支原体则无交叉杂交。
M.Jenkins用Southern印迹来研究球虫的基因表达、基因的基因组构成以及它们在球虫不同种的分布。能特异性地鉴别球虫特定的发育阶段的探针也已制备。此外，还研制出了以诊断为目的、具有种特异性的其它探针。
K.S.Henderson等(1990)通过点印迹法，用cDNA探针来检测感染鸡体内的IBDV抗原，并用琼脂扩散试验和免疫荧光试验来作比较。结果用后两种方法在接种病毒2天后即可从鸡的组织中检出病毒抗原，检出的持续时间分别为3天和4天。而用点印迹法在接种病毒后1天即可检出病毒抗原并且在整个试验期里(24天)均可检出。这表明点印迹法比其它两种方法都敏感。
K.P.Snipes等(1990)应用REA及Southern印迹法可将分离自火鸡的多杀性巴氏杆菌的疫苗株(M9)和致病株相鉴别，尽管两者在血清型或荚膜型、生化特征、抗药性、全细胞蛋白的PAGE图以及质粒的内容等方面完全相同。为禽霍乱流行病学研究提供很有用的工具。除上述这些应用之外，分子杂交技术还可用于进行细胞原位杂交。此项技术是在保持细胞，甚至单个染色体形态的情况下，检查细胞内某些基因位置的一种有效的分子工具。它在诊断生物学、发育生物学、细胞生物学、遗传学和病理学研究上均得到广泛的应用。原则上它保持了核酸和细胞的形态，用标记的探针与之杂交，最后显影。影响试验的因素包括基因的性质及探针的大小。在包埋的或冰冻的切片中的待检样品用固定剂处理。交联固定剂如甲醛，可降低细胞的渗透性，这样反过来就需要较小的探针才能使之透入细胞，结果就使此方法的灵敏度下降。因此，固定剂及探针的选择是关键。探针可用被荧光标记或与酶联结的放射性核苷酸来标记。原位杂交是一项很难掌握的技术。因为许多的实验条件都很关键。
E.Tanizaki等(1990)用生物素标记的探针与经福尔马林固定的鸡皮肤上皮细胞进行原位杂交，以检查禽痘病毒(FPV)在感染细胞内的分布。结果表明FPV的DNA局限于细胞浆内。
D.Tripathy发展了一种凝胶原位杂交。杂交可接在琼脂糖凝胶上进行，而不需将其转移到固体载体上。由于减少了一个步骤和取消了膜的使用，从而使此方法简单化、缩短了时间，而且减少了经费的使用。
作者单位：广西大学动物科技学院 530005
