第三大类是经典的小鼠突变模型大多是通过对自发突变的筛选与培育得到的，但是小鼠发生自然突变的概率大约只有20 万分之一，所以期待运用自然突变进行饱和突变筛选完全不可能实现。在众多科学家的努力下，小鼠基因组改造技术已经非常成熟，成为功能基因组研究的最主要手段之一。证明一个特定基因的在某个器官或发育过程中的功能不外乎要给出三个证据：首先，要确证该基因在此器官或发育过程中特异性表达；其次，证明运用分子生物学手段“剔除”或“敲落”该基因导致器官功能或发育调控的异常；最后，改变该基因的表达特异性也可能导致器官功能或发育调控的异常。前一个问题涉及RNA和蛋白水平的分析，而后两个证据则主要依赖于基因剔除和转基因的手段。运用基因组改造技术建立起来的疾病模型，不仅仅对生物医学的基础研究至关重要，而且对发现新的药物靶标、新药筛选等有重大意义。
目前基因组改造技术又可以分为三类：一是通过物理或化学方法在小鼠生殖细胞DNA中随机诱导单个或多个碱基的突变形成，然后通过与野生型小鼠交配，将突变传给后代；二是通过ES 细胞或受精卵原核显微注射，在基因组中随机插入特定的碱基序列，转基因技术、“基因陷阱”技术及转座子技术可以归到此类；三是在基因组的特定位置插入或者删除特定的碱基序列，即基因定位突变，基因剔除(knock-out)和基因敲入(knock-in)属于此类。
第一类技术中又可以分为辐射诱变和用化学药品诱变两种。这两种方法在制造突变体上的应用都已经有很久的历史，果蝇突变体的筛选最初就是使用X 射线诱变的方法来实现的。一般来说，小鼠配子基因组中辐射诱变的概率是2 000 到8 000 细胞中有一个基因会发生突变，常规化学药品诱变的概率与辐射诱变概率差不多。但由于小鼠的生殖能力并没有果蝇那么强，所以用辐射诱变和如苯丁酸氮芥(chlorambucil)等常规化学药品的效率相对于小鼠来说是比较低的，也较难实现。目前小鼠诱变研究中主要使用突变剂是Ethylnitrosourea (ENU)[10]。ENU主要诱导产生点突变，诱导效率为每700 个后代中就有1 个基因发生突变。由于ENU 的高效性、突变随机性好、方法相对简单，加上人类遗传疾病大多由点突变造成，因而目前ENU诱变仍是建立疾病模型的一个重要途径，受到许多实验室青睐。但是，这一方法获得的突变小鼠由于突变位点没有标志，后期的突变基因染色体定位需要花费较多时间。
第二类技术是利用ES细胞或受精卵有丝分裂时会发生外源DNA整合进基因组的现象导入外源基因或DNA 片段。当有意识将表达载体插入基因组时，外源基因会在特定启动子的作用下在特定组织或器官表达，我们称此外源基因为“转基因”。由于“转基因”是随机插入基因组，有5%~10% 的机会“转基因”将插入功能基因结构区，导致基因突变。借助相似思路，基因陷阱(gene trap)就是将一个不完整的表达载体插入基因组，和基因组结构整合形成新的基因表达单元。基因陷阱包括增强子陷阱(enhancer trap)、启动子陷阱(promoter trap)和基因陷阱等，通过这些方法插入的报告基因(如β- 半乳糖苷酶LacZ，绿色荧光蛋白GFP 等)的表达情况，可以提供增强子、启动子和基因的相关表达信息。同时，插入片段破坏基因产生的异常表型，又反映了该基因的功能。由于这种方法在突变位点引进了特定DNA分子标志，所以突变基因可以通过简单的分子生物学分析迅速找到。但是，由于DNA分子体积大，在基因组上的插入有“热点”和“冷点”，一般认为基因陷阱不能用于饱和诱变[11~12]。
第三类技术利用了ES 细胞内DNA的同源重组过程，导入的DNA片断上含有与基因组某段序列相同的碱基序列。这些序列会与基因组上的相同序列发生同源重组后，结果导致两段DNA同源臂之间的序列发生了置换。虽然同源重组的概率只有百万分之一，但如果在置换区带上可筛选标记基因(如新霉素磷酸转移酶neo，胸苷激酶TK 等)，我们可以特异性筛选重组取代原有基因序列的细胞克隆，实验的结果通常可以获得几乎100%的基因突变后代。这种方法的实际应用有两种形式：一是序列置换导致基因的失活，这被称为基因打靶或是基因剔除;二是取代的序列中只引进特定突变(特别是点突变)，这被称为基因敲入。基因敲除是目前研究某种基因功能最直接的方法，到2002 年6 月已报道的基因敲除小鼠品系已达到了3 000 种以上。
在进化过程中，同一基因常常在不同的发育阶段及不同的器官发挥不同的功能，这也是人类仅有3万个基因但能控制高度有序的复杂结构模式及稳态的基础。另一方面，肿瘤等复杂疾病的主要发病机制是发生于不同组织与器官的体细胞突变。因此，要真正阐明基因在特定组织的功能，真实模拟特定肿瘤突变，建立合适的疾病模型，必须采用组织特异性基因剔除小鼠的方法。
目前建立组织特异性基因剔除小鼠的方法是首先通过同源重组建立基因“flox”小鼠和通过受精卵原核注射建立组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。“flox”小鼠基因组中靶基因的编码区两端通过同源重组插入了可被Cre重组酶识别的LoxP位点。在没有Cre 表达时，该基因的表达和功能不受影响。但是，在表达Cre 的细胞内，Cre 将删除两个LoxP 位点之间的序列，从而导致该基因在此细胞内失活。所以，通过“flox”的小鼠与组织特异性表达Cre 转基因小鼠的交配，可以得到在特定组织剔除该基因的小鼠模型。
基因功能的研究可以在三个层次展开，分子层次主要从结构域和位点分析到分子间相互作用，细胞层次研究探讨细胞分化、增殖、凋亡等行为的机制。但是，对于复杂生物，特别是包括人类在内的脊椎动物，整体动物研究层次才能彻底和全面的阐明基因的生理功能及其在疾病发生过程中的作用。以血糖的稳态调控为例，多个器官和基因的相互作用只有在整体水平才能得以说明。胰岛素、瘦素和GLP1 等关键内分泌分子的靶器官包括肝脏、肌肉、大脑等多个组织，其分泌和代谢过程也涉及多器官和细胞类型，因此其作用的效果只有在整体动物水平才能得到系统说明。通过在特定组织剔除特定基因，分析其对整体动物生理生化过程的影响，是最准确、也是最明确的基因功能研究手段。目前，只有小鼠具有成熟的基因剔除技术，充分反映了小鼠在基因改造领域的得天独厚的优势。
