牛主动脉HUVEC的培养
1/取材：切开新生小牛胸部组织将心脏推向右侧，即可模及心脏下面靠脊柱的胸主动脉，然 后切下主动脉，以HaNK’S液保存血管。
2/操作：以PBS冲洗血管，分离血管结缔组织但不要分离的太干净以免血管外漏，然后用止血钳钳住血管一端，外翻血管用手术线结扎血管一端。
3/消化：0.25%胰酶、37度、过剩分钟消化，血清终止收集此液。
4/离心：10分 1000rpm/分离心，PBS洗一边。
5/培养：M199+20%胎牛血清+1%L谷氨酰胺+1%青链霉素；
1万/平方厘米HUVEC数接种于玻璃瓶上；
37度、5%CO2培养；
每24小时半量换液，72小时汇合成单层。
6/传代：以0.25%胰酶消化2分钟PBS洗一边，传代可传至22代，一般前3代性能稳定可用 作实验。
人脐静脉HUVEC培养
1/脐代：20CM 、无血丝块不超过24小时HaNK’S液无菌保存的脐带。
2/操做：无菌条件下，以自制插管插入脐静脉两端，用手术线扎牢使之不易脱落及漏液，以PBS冲洗，使之无血块，后用0.25%胰酶注入血管使之微微胀起，37度，30分钟消化，牛血清终止胰酶，收集此液。
3/离心：10分 1000rpm/分钟，PBS洗一边。
4/培养：M199+20%胎牛血清+1%L谷氨酰胺+1%青链霉素；
1.5万/平方厘米HUVEC数接种于进口塑料培养瓶中；
37度、5% CO2条件下培养；
每24小时半量换液一次，72小时HUVEC汇合成单层。
5/传代：以PBS洗净要传代HUVEC（不能残留培养基成分）；
用0.25%柠檬酸胰酶消化3分钟，牛血清终止胰酶收集此液，PBS洗一边，10分钟1000rpm/分离心；
完全M199培养、3万HUVEC/平方厘米数、进口塑料培养瓶、37度、5% CO2培养；
每24小时半量换液，72小时HUVEC汇合成单层；
6/注意：人脐静脉HUVEC在没有生长因子条件下只可传3代，随代数增加细胞性能减弱。
HUVEC
|
题目日期 |
HUVEC数cm2 |
胰酶 % |
消化时间 |
融合时间 |
HUVEC传代 |
胰酶% |
消化时间 |
融合时间 |
|
96.630 |
1.5万 |
0.25 |
0.5h |
72h |
2 |
0.25 |
0.5h |
72h |
|
96.701 |
2.0万 |
0.25 |
0.5h |
72h |
2 |
0.25 |
0.5h |
72h |
|
96.702 |
1.4万 |
0.25 |
0.5h |
72h |
2 |
0.25 |
0.5h |
72h |
|
96.703 |
1.7万 |
0.25 |
0.5h |
72h |
2 |
0.25 |
0.5h |
72h |
|
96.704 |
2.0万 |
0.25 |
0.5h |
72h |
2 |
0.25 |
0.5h |
72h |
|
96.705 |
1.5万 |
0.25 |
0.5h |
72h |
2 |
0.25 |
0.5h |
72h |
|
96.706 |
2.1万 |
0.25 |
0.5h |
72h |
2 |
0.25 |
0.5h |
72h |
|
96.707 |
1.4万 |
0.25 |
0.5h |
72h |
2 |
0.25 |
0.5h |
72h |
|
96.708 |
2.0万 |
0.25 |
0.5h |
72h |
2 |
0.25 |
0.5h |
72h |
|
96.709 |
1.5万 |
0.25 |
0.5h |
72h |
2 |
0.25 |
0.5h |
72h |
1.2抗体的制备
用培养好的第一代或第二代内皮细胞免疫Balb/c小鼠，共三次，每次间隔四周，107个细胞/（次，只），融合前三天尾静脉注射106个细胞/只加强免疫。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%聚乙二醇3350（PEG）作用下融合，HAT培养液选择性培养。采用间接免疫荧光法对杂交瘤细胞上清进行筛选。选出与内皮细胞反应阳性且与血细胞反应阴性的杂交瘤细胞，经过有限稀释法克隆化建系。并将此杂交瘤细胞接种于Balb/c小鼠腹腔制备腹水。
