二.荧光标记
1.TaqMan Probes
TaqMan探针通常在5’端以荧光基团FAM标记，靠近3’端以荧光基团TAMRA标记，3’端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。下表列出了两种荧光基团的吸收及发射波长。

2.Hybridization Probes
Hybridization探针技术中，上游donor Probe 3’端以荧光基团Fluorescein标记；下游acceptor Probe 5’端以Roche的LC-Red 640标记（当用双荧光基团时还可同时使用LC-Red 705），3’端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。也有文献报道acceptor Probe 5’端以Cy5标记，下表列出了各种荧光基团的吸收及发射波长。

3.荧光标记基团与PCR仪的激发与检测波长
由于荧光标记基团的选择还受到定量PCR仪所提供的激发和检测波长的制约，所以这里介绍一下临床应用中主流机型所提供的检测波长，见下表。

三.TaqMan Probes技术要点
TaqMan Probes技术要求所用的热稳定DNA聚合酶不但要具有5’→3’外切酶活性,而且要求所获得的扩增曲线符合PCR反应动力学。
Matthew J.Longley等（1990）研究了热稳定DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性,认为：（１）其5’→3’外切酶活性和DNA聚合酶活性位于同一肽段；（２）5’→3’外切酶活性依赖于双链DNA（如右图）；（３）5’→3’外切酶活性具有热稳定性，之所以70℃较50℃活性低（如右图）是由于高温破坏了探针与模板间的双链结构。
K-A.Kreuzer等（2000）研究了15种热稳定DNA聚合酶（商品）的5’→3’外切酶活性，其中7种声称具有5’→3’外切酶活性，右图是这７种酶的定量PCR反应（TaqMan）曲线,其中部分酶没有5’→3’外切酶活性、部分酶具有较弱的5’→3’外切酶活性、只有一种酶的扩增曲线（A）符合PCR反应动力学。

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