贾蕊 朱若华*
(首都师范大学化学系 北京 100037)
摘 要 毛细管电泳法以其进样量少、操作简便、分辨率高、易于分离和定量、试剂消耗量少、分析时间短等优点，越来越广泛地应用于酶体系的动力学研究中。本文介绍了近三年来毛细管电泳法在酶反应动力学研究中的应用，包括酶反应动力学参数的测定、抑制动力学以及蛋白质-药物和蛋白质-蛋白质络合常数的测定三个部分。
关键词 毛细管电泳 酶 动力学 抑制剂 络合常数
Application of Capillary Electrophoresis Method in the Research of Kinetics of Enzyme Reactions
Jia Rui, Zhu Ruohua*
(Department of Chemistry, Capital Normal University, Beijing 100037)
Abstract Capillary electrophoresis is a convenient tool for studying kinetics of enzymatic system due to many attractive features such as low sample volume, easy to operate, high separation efficiency and resolution, minimal reagent use, and short analysis times. In this paper, the application of capillary electrophoresis method in the research of kinetics of enzyme reactions was introduced in the past three years, including three parts in details: the measurement of kinetic parameters of enzyme reactions, the research of kinetics of inhibitory activities and the determination of binding constant of protein-drug and protein-protein.
Key words High performance capillary electrophoresis, Enzyme, Kinetics, Inhibitor, Binding constant
1967 年Hjerten[1]最早提出毛细管电泳技术，并在3mm 内径的管子中使用高场强进行自由溶液的区带电泳(CZE)。到了20 世纪80 年代，毛细管电泳技术取得了突破性的进展，Jorgenson 等[2]用75μm 的毛细管，采用柱上荧光检测成功分离了氨基酸及多肽物质，获得了40 万的理论塔板数，并实现了正、负离子的同时分离。近几年来毛细管电泳技术已经成为分析化学中发展最为迅速的领域之一，它具有快速、高分辨率、高灵敏度和样品用量少、成本低等优点，在生物分析和生命科学领域中有极为广阔的应用前景。
1995 年以后，毛细管电泳法越来越多的应用于多肽、蛋白质和酶的检测中，特别从1999 年开始，毛细管电泳法在酶的动力学研究中取得了相当大的进展。本文分三部分介绍了近三年来毛细管电泳法在酶反应动力学中的研究和应用。
1 毛细管电泳在酶反应动力学中的应用
酶反应的基本动力学关系，是指酶反应速度与酶和底物间的动力学关系。描述这种基本动力学关系的是米氏方程(Michaelis-Menten equation)。该方程提供了两个极为重要的酶反应动力学常数：米氏常数Km 和转化率Kcat，通过这些参数表达了酶反应性质、反应条件和酶反应速度的关系。其中，Km 是一个特征常数，Km 越大，说明酶和底物的亲和力越小，越容易解离。所以，在酶反应动力学中，关键是要测得其米氏常数Km。
测定酶反应动力学的方法很多，主要包括分光光度法、荧光法、放射免疫法以及薄层和液相色谱法等。近年来，毛细管电泳法以其进样量少、操作简便、易于分离和定量、无需引入有机溶剂等优点，越来越广泛地应用于酶体系的测定中。毛细管电泳不但具有多种分离模式(如区带毛细管电泳CZE、胶束电动毛细管电泳MEKC、凝胶毛细管电泳CGE、亲和毛细管电泳ACE、等电聚焦毛细管电泳CIEF、毛细管电色谱CEC 等)，还有多种检测模式(如紫外、二极管阵列PDA、荧光[3]、电化学检测器等)，更加适于酶反应动力学的测定。
在毛细管电泳法测定酶反应动力学参数的研究中，最常用的测定酶活力的方法是区带毛细管
电泳法[4]。Zhang 等[5]用区带毛细管电泳法测定了血管紧张素转化酶(ACE)的活性、米氏常数和最大反应速度。在式(1)所示酶反应体系中，以产物峰面积对浓度进行回归分析，得到线性回归方程，通过监测不同底物浓度下产物的峰面积，计算出酶活力，根据米氏方程用Lineweave-Burk作图法得到米氏常数和最大反应速度。此法分离重现性高，分析速度快，试剂消耗量少。酶与底物总量仅需要150μL，并且无需加入有机溶剂，6min 即可完成分离，8 次测定迁移时间及峰面积的相对标准偏差可分别达到0.15%和0.71%。………………
