两种方式测得浓度具有很高的线性相关性。活性抗体的含量可以用活性分子的浓度除以总蛋白浓度。如图3所示的数据显示，这个比值非常接近100%，说明抗体非常纯而且没有失活。
抗体活性的质量控制
在制药和诊断企业，经常需要测定不同批次抗体的质量和活性。在这部分，我们证明ITC可以简便快速确定不同批次间抗体的差异，而不仅仅是用“好”与“坏”来衡量。奎纳定(Quinidine)是奎宁(quinine)的R-异构体（图4），主要用于治疗心律不齐。由知名厂商提供的两批奎拉定抗体通过ITC进行了评估（表1）。滴定在同样的条件下和相同浓度完成。如表1所示，较差的产品活力只有较好产品的15%。这个结果也得到亲和色谱实验验证。
表1 抗奎拉定抗体的结合研究
对于“好”“差”不同的抗体，ITC测试在1.3ml的样品池中进行测定，抗体蛋白浓度为6μM（通过OD280测定），对于偶联的抗体浓度，通过测量溶液中抗体的减少量来确定。通过每次滴加10μl奎拉定进行测定(对于“好”“差”两批抗体，奎拉定浓度用132μM，对偶联的抗体，奎拉定用66μM），滴定间隔4分钟。实验结果通过Origin进行分析，以确定结合常数、结合热ΔH和活性成分的含量。
偶联对抗体活力及亲和力的影响
奎拉定抗体共价偶联于磁珠上。偶联于磁珠的抗体通常放到一个含有抗原物的混合溶液中搅拌，当抗原结合到磁珠上的抗体后，利用磁场将磁珠分离开，然后进行抗原的分离纯化。然而，偶联通常会影响抗体的活性和亲和力。这就需要加入更多的磁珠偶联的抗体。ITC是一种方便可靠的方法可以快速确定需要多加入多少磁珠偶联抗体以克服活力降低带来的影响。我们研究了好的抗体偶联到磁珠后活力的变化，如表1所示，偶联后活力只有偶联前的40%左右。另外，偶联到磁珠之后，亲和力相比于偶联前下降了将近20倍。这说明偶联会严重影响抗体与抗原之间的亲和力，这可能是由于抗体被偶联后影响了与抗原的结合行为所致。
ITC方法的精确性
为了研究ITC方法用于抗体结合活力的精确性，对同一使用者，利用相同的试剂，在两天时间内，十一次测定了茶碱与抗体之间的相互作用。从表2的数据来看，ITC方法用于测定抗体活力以及结合热的变化只有1%左右。对于测定亲和力常数，ITC方法的误差约10%，对于亲和力这种难以准确测定的参数，ITC算是一种准确的方法。这说明ITC用于研究抗体的活性和亲和力，是一种精确并具有较高重复性的方法。
表2 . 重复进行抗原抗体结合实验获得的统计结果
相同的抗原抗体进行11次重复实验，每次实验共进行20次滴定，1.33ml样品池中抗体的浓度为3.6μM，每次滴加5.0μl 160μM的茶碱。实验结果通过Origin分析，得到结合常数Ka,结合热 H，以及活性分子的含量。活性分子的含量通过结合的茶碱分子数，除以抗体分子总结合位点数（每个分子有两个抗原结合位点）。通过11次的结果计算标准偏差、变异系数（CV）以及结合常数等。
结 论
通常一批抗体产品中总蛋白的量通过光谱方法确定，而活力通过不精确的凝胶扩散实验测定。ITC可以快速而精确地确定抗体产品中活性分子的含量以及结合常数。这些信息对于确定不同批次间抗体的差异、抗体的性质以及质量控制参数非常有用。
结合参数测定利用ITC通常只需要30min到60分钟即可完成。相比于凝胶扩散以及平衡透析可以节省很多时间，这两种方法通常需要一天甚至更久的时间。另外，该方法同一使用者测得的变化很小，说明该方法非常精确，用来测量多个样品时非常可靠。该方法的另一显著优点是ITC是真正的完全在自由溶液完成测定，无须对相互作用的分子进行任何化学修饰。表面等离子共振以及荧光法都需要修饰，这可能会对结合产生较大的影响。这种情况可以从奎拉定抗体被偶联到磁珠后的活力降低看出来（表1）。
