聚焦时间的优化
理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。
聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。
过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。
最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。 
两维间的平衡
一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于－80°保存数月。
但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS-PAGE是电泳能顺利进行。
建议方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mM Tris（pH8.8）缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15min。如果用TBP代替DTT则只需一步平衡。
二维SDS-PAGE
同普通SDS-PAGE类似。
但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。
聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测
理想显色剂的7S
安全（safety）：
灵敏（sensitivity）：
简单（simplicity）：
特异性（specificity）：
快速（speed）：
稳定（stability）：
兼容性（synergy）：
有机染料和银染
考染灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。
胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为8~10ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。
胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。
银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。
这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。
负 染
能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。
结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。
速度快（5~15min），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。
它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。
该技术主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用。
