样品中核酸的去除
对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。
解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。
亚蛋白质组样品的制备
用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。
顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。
第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；
第二步：把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取高疏水性蛋白；
第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。
特殊样品的制备
低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级＋窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。
强碱性蛋白质（如核糖体 ）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3－12、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。
极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。
一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）：
IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3~10不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。
IPG胶条的重泡胀
泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。
不同的加样方法和加样量会导致最终结果的差异：
Protean IEF cell、IPGphor等集成设备的使用：
20mmol/L DTT 垫片的使用
温度的选择
蛋白载样量
影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括：
待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。
电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需考虑太多其它因素。
待研究蛋白的丰度：
样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
IPG胶条的pH范围：
IPG IEF 中pH梯度的选择
常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。
