2.1 固定液的选择
固定液的选择是免疫组化技术成功与否的基础。用于免疫组织化学技术的固定液种类较多，性能各不一样。不同抗原，其稳定性各不相同，对固定液的耐受性差异较大。所以，除要了解不同固定剂的特性外，不同的抗原和标本需经过反复试验，必要时可作多种固定液对比，从而选出理想的固定液。选择最佳固定液的标准是：①最好地保持细胞和组织的形态结构；②最大限度地保存抗原的免疫活性。中性缓冲多聚甲醛（或福尔马林）液是适应性较为广泛的固定液。值得注意的是免疫组织化学技术中禁用含重金属的固定液。
2.2 固定时间因固定液而异
组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
2.3 固定方法的选择
常用的固定方法有两种：浸入法和灌注法。浸入法即将组织浸泡在固定液内（必要时在4℃下），固定时间根据抗原的稳定性以及固定液的性质而定，一般在2-12h之间。灌注法主要适用于动物研究，灌注固定不仅可以使固定液迅速到达全身组织充分固定，而且灌注能冲洗掉红细胞，排除过氧化物酶的干扰。
2.4 固定时应注意
力求保持组织新鲜，勿使其干燥；组织块不宜过大过厚，以体积<2cm×1.5cm×0.3cm为宜，组织块厚度必须控制在0.3cm以内；固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中固定不良而影响效果；组织固定后，应充分水洗，去除固定液，以减少固定液造成的人为假象。
（二）切片方法-细节注意
1 切片方法的选择
光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。
1.1 冰冻切片
是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。冰晶小而多，对组织结构损害大。因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（约1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
冰冻切片一般用恒冷切片机。切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，
进行短暂预固定干燥后贮存于低温。
1.2 石蜡切片
用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃下进行，以尽量减少组织抗原的损失；②组织块大小应＜2cm×1.5cm×0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸蜡；浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以熔点低的软蜡较好。组织块脱水、透明和浸蜡时间可参考下表：
表1 组织块处理时间
目前我校形态学部配备有全套自动脱水仪，一系列过程都可实现自动化，有意要做石蜡切片的同学可与王亚琴老师联系。
