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FCM 医学生物学应用和进展
作者:石学耕 来源:上海第二医科大学细胞生物学实验室 时间:2007-12-6

    淋巴细胞和单核细胞等激活后能分泌各种不同的细胞因子,它们是调节体内免疫反应的重要体液因素。由于细胞内细胞因子含量很低,并且一旦合成立即被分泌到细胞外。因此在单个细胞水平上检测细胞因子分泌能力是十分困难的。随着FCM仪器测量灵敏度的提高和样品制备技术的发展,FCM现已可在每一个细胞上同时检测两个至三个细胞因子的合成分泌能力。这种方法目前已广泛用于各种免疫异常疾病的研究中,如SL E、类风关、哮喘等。
    FCM 细胞 DNA含量测定方法已大量用于肿瘤细胞学的研究,并用于临床肿瘤的诊断、疗效评价和预后估计等。 DNA异倍体细胞群的多少、其DNA含量偏离的程度以及肿瘤细胞中增殖细胞的百分比值等重要信息,在正确判定临床肿瘤生物学特征,如肿瘤生长、转移、复发和评价肿瘤化疗疗效等都有重要的意义。FCM 细胞DNA含量分析还大量用于各种渗出物、分泌物等的检查,如对胸水、腹水、痰液、尿液、膀胱冲洗液、宫颈括片细胞液等的检查。这在人群肿瘤筛选检查、肿瘤患者随访以及病理细胞学自动化研究等都有一定的意义。
    血液学是研究造血组织、血细胞发生以及血液功能等的一门综合学科,涉及到细胞生物学、免疫学、细胞遗传学、肿瘤学等多个生物学领域。由于血液样品采集方便,又可反复取样,样品中各种细胞成分呈分散悬浮状态,很适合FCM 分析分选等研究,因而血液学是FCM技术首先的和重要的应用领域。
    FCM网织红细胞精确计数已用于多种生理病理状态的研究。随着单克隆抗体试剂和荧光细胞化学方法的发展, FCM已可对全血标本进行多种细胞成分的分类计数,包括血小板和激活的白细胞亚群计数等。
    FCM是研究造血干/ 祖细胞的重要手段之一。 造血干/ 祖细胞在各种来源的标本中百分含量很低。但它们具有自我更新、自我维持并向多系血细胞分化和旺盛的增殖能力,以维持一生中机体对全身血细胞的生理需求。通过单个细胞集落培养、细胞再植能力检查、形态学观察、细胞免疫表型等研究,已知细胞表面 CD34 抗原表达阳性可作为早期干/ 祖细胞的标志。在其中,根据CD38,CD33,HLADR, CD 45R 0 等分化抗原还可进一步分成若干细胞亚群。它们在形态学上都是原始幼稚细胞,无法辨认和区分。但其中只有一小部分是造血干细胞,存在于CD34+/ CD38- 细胞亚群中,大部分细胞还是属各分化阶段的祖细胞。干/祖细胞的生物学特性以及整个造血过程的调控目前还不甚了解。要进行深入的研究,首先要将这些为数很少的干/ 祖细胞及其各亚群细胞分选纯化出来。FCM的多参数细胞分选( Sorting )纯化技术和单个细胞的分选技术(ACDU)已给造血干/ 祖细胞的研究以极大的推动并将进一步影响该领域研究的深入发展。
    血液病包括血液肿瘤性疾病、血液免疫性疾病、血液遗传性疾病等。其中恶性血液病(白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、骨髓增生异常综合征等)约占一半以上。白血病是最常见的恶性血液病,占青壮年恶性病的首位。在各种血液病的发病机理、诊断、分类、治疗反应和预后判断等诸多方面的研究中,FCM技术发挥了十分重要的作用。 FCM细胞多参数定量分析使血液病研究进入了一个更精确、更客观的水平,已成为各种血液病研究不可缺少的一个组成方面。
    白血病的分类是选择治疗方案和判断预后的重要依据。白血病是造血系统的恶性肿瘤,具有肿瘤细胞的特征,其抗原表达不完全同于正常血细胞,不具有严格的系列性和阶段性,常出现某些抗原缺乏、过度表达、系列交叉表达或表达某一阶段不应有的抗原,因而FCM可依据其抗原表达的异常图谱对白血病进行定型。增殖细胞核抗原( PCNA,Ki-67 等 )以及细胞周期蛋白( cyclings )等的研究正在大量开展。各种癌基因,抑癌基因及其蛋白产物与白血病细胞增殖异常的关系以及在白血病发病机理、治疗反应及预后等方面的意义也正在探索、研究之中。
    微小残留病变( MRD )是白血病复发的根源。及早探测 MRD ,及早医治,可避免复发,延长缓解期。常规形态学检查、细胞化学方法以及血清学方法是难以发现 MRD 的。目前大多用细胞表面抗原检查、细胞遗传学(如FISH 荧光原位杂交)方法和多聚酶链反应法( PCR ) 来检测MRD。FCM检测MRD 有其独特的意义,因为目前尚未发现白血病的特异性共同肿瘤标记。FCM细胞多参数分析可从大量细胞中将少于1%的异常特殊免疫表型组合或DNA非整倍体的少量细胞检测出来。
    全反式维甲酸(ATRA)诱导早幼粒白血病细胞分化成熟。使M3 白血病完全缓解率( CR )达 85%,第一次将诱导分化治疗方法成功地用于临床人体恶性疾病。在分析诱导分化剂作用机理与判断细胞分化阶段的研究中,除形态学观察和细胞功能试验外,FCM技术快速、定量和细胞多参数分析的特点使其成为一个重要的研究手段。细胞分化成熟伴随着一系列细胞功能状态的改变,FCM的一些细胞功能分析方法也正在积极发展之中。诱导恶性细胞凋亡是近年来肿瘤治疗的新策略。我国学者利用砷剂治疗早幼粒白血病取得很高的完全缓解率。特别是对一些多药耐药病例,同样可取得相当高的完全缓解率。
    FCM还大量用于其他一些恶性血液病中的研究中,如淋巴瘤、骨髓增生异常综合征( MDS )、慢性淋巴细胞白血病( CLL )、慢性粒细胞白血病(CML)、骨髓瘤、血小板功能异常疾病等。
    最近世界卫生组织(WHO)已公布了全新的血液淋巴组织肿瘤分类标准和世界卫生组织肿瘤国际组织学分类手册,该分类标准将传统的细胞组织形态学和临床特征与现代的免疫表型和遗传变异相整合,比现有的FAB白血病分类方案,多种淋巴瘤分类方案有明显的改进和提高,已在欧美,日本等西方国家中开始逐步采用,成为血液肿瘤的国际标准分类方案。这种新的WHO 分类标准中免疫表型主要是依靠FCM来检测。
    FCM的应用范围隨着仪器向更多参数和更快的速度等方向发展还会有进一步的扩大。同时,值得特别关注的是 FCM利用非生物小球(Beads )作检测载体定量分析各种液体标本中可溶性蛋白物质的新技术。近年来,这种技术己有成功的商品化发展。BD 公司首先推出了CBA试剂用于定量血清中各种细胞因子的含量。而Luminex 100己成功地实现在同一液相标本中同时快速分析100种不同的可溶性生物分子,可以是各种细胞因子、各种趋化因子、各种激素分子、各种蛋白激酶、各种细胞信号转导相关蛋白以及各种核苷酸片段等。这种液相分析新技术仅需要微量标本,操作简单,实验重复性好。利用FCM多荧光通道和多色荧光标记Beads,这种技术可实现上万种或更多生物分子的同时检测分析,故被称为液相芯片分析系统。一些专家估计,今后五年到十年这项技术将进一步完善成熟,并将替代目前广泛使用的一些常规技术,活跃在临床医学检验和医学科学研究领域,有很好的应用前景。

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