1.2 方法
1.2.1 线粒体的提取
称取1~10 g 黄化苗, 加入5 倍体积预冷的匀浆缓冲液A(50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 1.3 mol/L NaCl, 25 mmol/L EDTA, pH 8.0, 0.2% BSA, 使用前加入0.05%半胱氨酸和0.5%β-巯基乙醇), 用预冷的研钵或匀浆捣碎机充分破碎组织, 经6 层纱布过滤, 滤渣加入3 倍体积的匀浆缓冲液A 继续破碎, 两次滤液合并后分装于15 mL 离心管。将滤液用 Eppendorf 5810R 高速冷冻离心机1, 000 g 离心10 min; 取上清液2, 000 g 离心15 min, 并重复此步操作。将得到的上清液18, 000 g 离心15 min, 弃上清, 得到粗线粒体沉淀。向每管沉淀中加入5 mL 预冷的匀浆缓冲液A, 并将沉淀重悬浮, 18, 000 g 离心15 min, 充分弃掉上清液, 得到较纯的线粒体沉淀。向沉淀中加入1 U/μL DNaseⅠ(Fermentas)5 μL, 10× buffer 10μL, 超纯水85 μL, 充分混匀后37℃温育1 h, 加入10 μL 0.5 mol/L EDTA, pH 8.0, 混匀后静置 10 min 以终止反应。然后加入2 mL ST 缓冲液(400 mmol/L 蔗糖, 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 0.1% BSA), 18, 000 g 离心15 min, 弃掉上清, 沉淀为无核DNA 杂质的线粒体(以上所有操作除特别说明外均在4℃以下或者冰浴中进行)。
1.2.2 mtDNA 的提取
向每管线粒体沉淀中加入1 mL 裂解缓冲液 B(25 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 20 mmol/L EDTA, pH 8.0, 0.5% SDS), 并加入蛋白酶K(Meck)至终浓度为100 μg/mL。将沉淀充分悬浮, 先50℃裂解1 h, 再37℃裂解1 h, 裂解期间每隔一段时间轻轻摇动一次。裂解结束后加入2 mol/L 醋酸铵100 μL, 并加入1 mL TE 饱和的酚/氯仿(1:1)抽提, 充分混匀, 静置10 min, 18, 000 g 离心5 min, 吸取上清, 并重复抽提一次。小心吸取上清, 将其分装于1.5 mL 离心管中, 并加入无DNase 的RNase A(Sigma)至终浓度为20 μg/mL, 37℃温育0.5~1 h, 然后加入2 倍体积的无水乙醇, 充分混匀, －70℃静置1 h, 18, 000 g 离心15 min, 所得白色mtDNA 沉淀在室温下干燥后加入 10~30 μL TE 溶液, 可于－20℃保存.1.3 mtDNA 的质量及纯度检测
(1) 取2.5 μL mtDNA 溶液, 加超纯水稀释至50 μL,用Eppendorf Biophotometer 紫外分光光度计分别测定A260/A280、A260/A230 及mtDNA 浓度, 并进行纯度分析。
(2) 取7 μL mtDNA 样品与1.5 μL 上样缓冲液混匀,0.8%琼脂糖凝胶电泳(4 V/cm)50 min, 用GeneGenius GBox-HR 凝胶成像系统照相检测mtDNA。
1.4 RAPD 扩增
用25μL 反应体系进行PCR 扩增, 反应体系含有模板mtDNA 25 ng, 2.5 mmol/L dNTPs 1 μL, 10×buffer 2.5 μL, 25 mmol/L MgCl2 2 μL, 5 U/μL Taq DNA聚合酶(Fermentas)0.3 μL, 10 umol/L 随机引物1 μL,剩余体积用超纯水补足。PCR 反应在MyCyclerThermal Cycler(Bio-Rad)上进行, 反应程序如下; 95℃预变性3 min; 94℃变性1 min, 37℃复性1 min, 72℃延伸2 min, 45 个循环; 72℃延伸5 min。 扩增产物经1.5%琼脂糖电泳检测。
2 结果与分析
2.1 mtDNA 紫外吸收光度分析
从紫外吸收光度测定结果(表1)可见, 本方法提取的mtDNA纯度高, 其A260/A280 介于1.8~2.0, 表明样品中无蛋白质或酚类污染; A260/A230 平均为2.09, 表明样品中基本不含有机试剂等干扰; 样品平均浓度为 2.24 μg/μL, 平均每克黄化苗可提取mtDNA 26.85 μg。（生物秀实验频道 www.bbioo.com）
表1 mtDNA 紫外吸收光度测定结果
Table 1 Results of spectrophotometry of mtDNA
