李文强, 张改生, 汪奎, 牛娜, 潘栋梁
西北农林科技大学 陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室, 杨凌 7121 00
摘要: 以小麦黄化苗为材料, 通过简单差速离心、DNaseⅠ处理得到无核DNA 杂质的线粒体, 用SDS 和蛋白酶
K 裂解线粒体, 经酚/氯仿抽提除去蛋白, 并用RNase A 消化而得到单纯线粒体DNA(mtDNA)。对所提取的
mtDNA 进行紫外吸收光度分析, A260/A280 平均为1.92, A260/A230 平均为2.09, 平均每克黄化苗可提取mtDNA 26.85 μg; 并对mtDNA 进行琼脂糖凝胶电泳和RAPD 扩增, 均得到清晰的电泳图谱。结果表明: 此提取方法得到的mtDNA, 不但产率高、结构完整, 而且能有效去除核DNA、RNA 和蛋白质等杂质, 获得高质量的mtDNA用于PCR 反应和各种遗传学分析。研究还发现, 通过调整线粒体裂解温度(先50℃裂解1 h, 再37℃裂解1 h), 亦可大幅度提高mtDNA 的产率。 （生物秀实验频道 www.bbioo.com）
关键词: 小麦; 线粒体; mtDNA; 提取方法; RAPD
An efficient method for isolation of mitochondrial DNA in wheat
LI Wen-Qiang, ZHANG Gai-Sheng, WANG Kui, NIU Na, PAN Dong-Liang
Key Laboratory of Crop Heterosis of Shaanxi Province, Northwest A & F University, Yangling 712100, China Abstract: An efficient method for isolation of mitochondrial DNA (mtDNA) from etiolated tissues of wheat was developed.The protocol consists of mitochondria isolation with differential centrifu gation, Dnase I treatment, lysis with SDS and proteinase K, removing protein by TE-saturated phenol/chloroform extraction and a final RNase A treatment for obtaining mtDNA. The mtDNA samples were tested using spectrophotometry and agarose gel electrophoresis. It was proved that the mtDNA isolated by this method not only have the high yield but also structural complete, and contains no impurities, such as nuclear DNA, RNA and protein. The result showed that this high quality mtDNA can be successfully used in PCR and other genetic studies. In addition, it was found that adjusting the lysis temperature has a noticeable effect on the mtDNA yield.
Keywords: wheat; mitochondria; mtDNA; isolation method; RAPD
线粒体是植物细胞重要的遗传系统之一, 提取高质量的线粒体DNA(mtDNA)是对线粒体遗传系统进行深入研究的基本前提, 也是开展植物细胞质雄性不育分子机理研究的先决条件。被称为生物界“哥德巴赫猜想”的细胞质雄性不育(CMS), 经国内外众多科学家近半个世纪的研究, 许多结果发现是由于花粉发育过程中线粒体正常呼吸代谢受阻, 从而导致小孢子败育[1~3], 而线粒体正常呼吸代谢受阻,多是由于线粒体呼吸链中蛋白编码基因表达异常引起[4, 5]。由于线粒体呼吸链蛋白是由核DNA 和线粒体DNA(mtDNA)共同编码, 因此发生在DNA 水平的线粒体遗传系统或核遗传系统的结构, 或者功能的改变均可引起线粒体呼吸代谢异常, 并导致细胞质雄性不育[6~8], 即细胞质雄性不育是质核互作的结果。
植物mtDNA 大多数为环状分子, 每个线粒体中DNA 分子数从几拷贝到几十拷贝不等, 且不同物种mtDNA 分子大小差别也很大, 从几十kb 到几千 kb 不等, 所以对于不同物种其mtDNA 提取方法很难统一。但总体来看, 植物mtDNA 提取方法, 主要有密度梯度离心[9, 10]和差速离心[11, 12] 等方法; 密度梯度离心得到的线粒体DNA 虽纯度高, 但操作复杂、耗时, 而且对材料的需求量大, 同时mtDNA 产率低, 且长时间高速离心对离心机亦要求很高; 普通的差速离心虽然操作简单, 但所提取的mtDNA纯度低、易降解, 以及核DNA、RNA 和蛋白质等杂质污染严重, 不能满足后续研究工作的需要。本文以小麦黄化苗为材料, 建立了一套高效的小麦mtDNA 提取方法, 所提取的mtDNA 具有结构完整、纯度和产率高, 能完全满足PCR 分析、基因定位、克隆等分子操作的需要1 材料和方法
1.1 材料
供试材料分别为小麦近缘种属的一些山羊草、对应山羊草细胞质的小麦异源细胞质雄性不育系、其它普通小麦变种细胞质雄性不育系, 以及由这些不育系与对应恢复系组配的F1 杂种。
(1) 山羊草: 粘果山羊草(Ae.kotschyi), 易变山羊草(Ae.variabilis), 偏凸山羊草(Ae.ventricosa), 二角山羊草(Ae.bicornis);
(2) 小麦细胞质雄性不育系: ms(Ae.kotschyi)- 90-110, ms(Ae.variablis)-90-110, ms(Ae.ventricosa)- 90-110, ms(Ae.bicornis)-90-110, ms(T.aestivum)-77(2), ms(T.spelta)-77(2), ms(T. timopheevii) -77(2), ms(T.aestivumPrim epi)-77(2);
(3) 不育系与恢复系组配的杂种F1: ms(Ae. kotschyi)-90-110×5253, ms(Ae.variablis)-90-110×5253, ms(Ae.ventricosa)-90-110×5253, ms(Ae.bicorni s)-90-110×5253, ms(T.aestivum)-77(2)×T6-3, ms (T.spelta)-77(2)×T6-3, ms (T. timopheevii)-77(2)×T6-3, ms(T.aestivum Primepi)-77(2)×T6-3;
(4) 保持系: 90-110, 77(2);
(5) 恢复系: 5253, T6-3; 其中保持系和恢复系均为普通小麦品种。
以上种子用5%次氯酸钠表面消毒10 min, 蒸馏水冲洗干净后室温下浸泡12 h 左右, 挑选已露白的种子铺于无菌滤纸上, 室温下避光培养7~10 天,收取黄化苗。（生物秀实验频道 www.bbioo.com）
