5．注意事项
所用KMnO4溶液及H2O2溶液使用前要经过标定，0.1mol/L H2O2要新配制。
（四）过氧化物酶（POD）活性测定及同工酶分析
1．过氧化物酶（POD）活性测定
在过氧化物酶催化下，过氧化氢分解成水和原子氧，原子氧能氧化联苯胺产生一种蓝色的化学物质，该蓝色化合物在波长580nm处有一最大吸收峰。蓝色物质的生成速度（dx/dt）与反应系统中过氧化氢分解速率呈正相关。因此，用分光光度计测出蓝色物质密度的变化（单位时间内反应液中光密度的变化），可以表示过氧化物酶的活性。
（1）试剂配制
0.1M pH8.5 Tris-HCl缓冲液：称取1.211g Tris-HCl溶于80ml蒸馏水，加36.5%HCl 0.42ml，用NaOH调pH至8.5，定容至100ml。
0.1M过氧化氢：1ml 30%的过氧化氢稀释到100ml。
0.005M 联苯胺醋酸－醋酸钠缓冲液：在200ml容量瓶中，先加入2/3的蒸馏水及2.3ml冰乙酸和184mg联苯胺。在50－60℃水浴中加热溶解，然后加入5.45g无水醋酸钠。待完全溶解后，冷却，加水定容到刻度线。
（2）酶液提取
将样品剪碎，称取1g，加入酶提取液（0.1M pH8.5Tris－HCl缓冲液）5ml和少量石英砂，在研钵中磨碎。然后再次加入5ml酶提取液稀释。转入离心管在1500rpm·min-1的速度下离心15min。上清液贮于冰箱中待用。
（3）酶活性测定
测定前，将酶液稀释300～500倍。吸1ml酶液，加入2ml联苯胺醋酸－醋酸钠缓冲剂，在28～32℃水浴中保温3～5分钟。测定时，加入1ml 0.1M过氧化氢，立即摇匀，并转入比色皿中，用分光光度计在波长580nm下测定光密度的变化。从加入过氧化氢起计时，每15s读数一次。
（4）酶活性的计算
过氧化氢与酶液接触后，立即产生蓝色物质，分光光度计上光密度读数不断上升，但随反应时间延长，光密度变化减小。在开始反应的45～60s种之内，光密度呈直线上升。取第15～45s之间的光密度变化，按下式计算样品中过氧化物酶活性。
E表示酶活性，单位为△O.D./mg F.W./Min。
研究表明，抗寒性强的品种POD活性高于抗寒性差的品种，且随温度下降变幅较缓。
2．化物酶（POD）同工酶分析
用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术分离POD同工酶。
（1）贮液的配制
A．30%Acr－0.8%Bis贮液：称取30gAcr和0.8gBis，用50ml重蒸水加热溶解，将溶液用定性滤纸过滤到100ml容量瓶内，定容后盛于棕色瓶中，于0-4℃冰箱中保存。
B．1M Tris-HCl缓冲液（pH值8.8）：称取121.14gTris用重蒸水溶解后倒入1000ml容量瓶中，用浓盐酸调pH值至8.8，最终加水定容至1000ml，然后用滤纸过滤，盛于棕色瓶中，放入0～4℃冰箱保存。
C．1M Tris-HCl缓冲液（pH6.8）：称12.114gTris用重蒸水溶解后倒入100ml容量瓶中，用浓盐酸调pH值至6.8，最终加水定容至100ml，然后用滤纸过滤，盛于棕色瓶中，放入0～4℃冰箱保存。
D．电极缓冲液：称取141.1g甘氨酸和30g Tris用重蒸水加热溶解后倒入1000ml容量瓶中，加水定容至1000ml。用时稀释20倍，调pH值至8.3。
E．1%过硫酸铵溶液：称0.5g过硫酸铵溶于50ml重蒸水中，放入0～4℃冰箱，可保存一周。
F．溴酚蓝溶液：称0.2g溴酚兰溶于100ml重蒸水中，配成0.2%。
（2）凝胶板的制备
①分离胶的制备
分离胶浓度多为7%，按照表5－3进行配制。先用刻度吸管准确地吸取30%Acr－0.8%Bis和1M Tris-HCl（pH8.8）于抽滤瓶中，用电动吸引器减压抽气，除去溶液中气泡，抽气毕，再加入1%过硫酸铵溶液和TEMED，摇匀后，小心地将凝胶加入凝胶板模具内，上面加一水层，在25～30℃的地方进行聚胶，约1h。
表5－3 分离胶的配制
TEMED（四甲基乙二胺）也可用DMPN（二甲氨基丙晴）或TEOA（三乙醇胺）替代。
