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植物多倍体鉴定技术
作者:陈晓流 来源:生物秀 时间:2007-11-29

    多倍体广泛分布于植物界,如普通小麦是异源六倍体,棉花是四倍体,栽培草莓是八倍体等,多倍体产生途径除自然发生外,化学药剂诱导是很有效的途径。不管以何种方式产生,检测、鉴定多倍体就显得很重要和迫切。
    鉴定多倍体,可采用间接和直接的方法。间接方法包括形态学和细胞学的观察,直接法是直接对试材检测染色体的数目。一般来讲,多倍体植物在形态学和细胞学上的特征表现为: 气孔、花器、花粉粒、种子、果实甚至叶片等明显变大,单位面积叶片上的气孔数目减少而密度降低等。考虑到染色体观察、记数较为烦琐,首先对试材从形态学和细胞学上来初步判断是否为多倍体,然后把初步断定为多倍体的试材再观察、记录染色体数目是否真正地发生了倍性的变异,从而最终确定为多倍体。
    芽变选种是无性繁殖植物育种的一种有效途径,多以嵌合体的形式存在,特别是多倍体芽变。通过检测梢端分生组织LⅠ、LⅡ 、LⅢ三层细胞的细胞、细胞核及核仁的大小,可以鉴定芽变材料倍性嵌合体的类型。
    本实验学习多倍体鉴定的基本方法。

    一、试材及用具
    1.试材:玉米、小麦、棉花、草莓、番茄、苹果等。
    2.用具:显微镜、剪刀、培养皿、载玻片、盖玻片、吸水纸、镊子、纱布、酒精灯、物镜测微尺、目镜测微尺等。
    3.试剂及配制
    (1)卡诺氏固定液: 冰醋酸1份,加纯(或95%)酒精3份,混匀,现用现配。
    (2)醋酸纤维素液: 称取10g醋酸纤维素,加入到100 mL的丙酮溶液中,用玻棒搅拌数分钟至醋酸纤维素全部溶解。
    (3)醋酸洋红染色剂: 取45 mL冰醋酸,加入55 mL蒸馏水,加热至沸腾,慢慢加入2 g洋红,煮沸约5 min,冷却后加入2% 硫酸亚铁。过滤,贮于棕色瓶中。
    (4)解离液: 铬酸2g,浓硫酸8 mL,浓硝酸3 mL,蒸馏水89 mL,充分混匀。

    二、方法步骤
    (一)间接方法
    1.形态学观察
    观察试材的形态学特征,例如叶片、果实、种子、花器等是否有较明显的增大现象,如果肉眼就能观察到明显的增大现象,说明试材很有可能是多倍体。不论形态上是否存在明显变异,还需观察、检测细胞学上的变化。
    2.细胞学观察
    (1)检测气孔大小和密度
    对叶背无茸毛的材料,可直接观察。取叶片用卡诺氏固定液固定,撕取叶片下表皮置载玻片上,滴上1~2滴醋酸洋红染色剂染色1~2 min,盖上盖玻片,用吸水纸吸去多余的染液,在显微镜下观察记录气孔保卫细胞长度、宽度和气孔的密度。
    对叶背有茸毛的材料,用印膜法观察。 选取生长健壮叶片,于叶背中部(避开叶脉)涂上一层均匀醋酸纤维素液,约5 min后形成一层薄膜,用镊子揭下薄膜,就除掉了叶背的茸毛。然后再往叶背涂一层醋酸纤维素液,注意要涂匀,在室内凉3~5 min,用镊子取下薄膜,置于载玻片上,加蒸馏水或醋酸洋红染色剂1~2滴,盖上盖玻片,在显微镜下观察气孔的大小和密度。
    对叶背茸毛多的材料,用解离液法观察。先用醋酸纤维素液去掉茸毛,然后把叶片剪成小块放入解离液中浸泡,直至表皮边缘与叶肉脱离翘起,放入清水中漂洗,揭下表皮,置于载玻片上,用醋酸洋红染色,盖上盖玻片,镜检。
    把临时制片在低倍镜下找到气孔,换用高倍镜,用目镜测微尺测量保卫细胞大小,求30个气孔大小的平均值。然后统计计算每个视野中气孔的数目,移动载玻片,换另外的视野,进行10次记数,用物镜测微尺测量视野的直径,计算出每个视野的面积,求出单位叶面积上的气孔的数目,即为气孔的密度。

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