最近新推出的带有荧光标记的siRNA表达载体更是广受到研究者的重视与欢迎。因为带荧光标记的表达载体，可以使我们通过荧光标记很容易观察到载体的转染效率及目的基因的沉默效率。可通过荧光显微镜观察含有shRNA的细胞或通过流式细胞仪富集被转染的细胞。同时荧光蛋白的表达与shRNA的表达是独立的，因此不影响shRNA基因沉默的效果。下面这个图就是使用BD CLONTECH的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen 和 pSIREN-DNR-DsRedExpress Vector转染HEK 293 细胞的结果。
Figure 5. Fluorescent RNAi-Ready pSIREN vectors generate effective, tagged shRNA expression cassettes (SECs). Using the BD™ Knockout RNAi Clone & Confirm PCR Kit, fluorescence-tagged SECs were generated by PCR from ligation mixtures of a negative control (–) or a luciferase (+) shRNA annealed oligo, and an RNAi-Ready pSIREN vector with a fluorescent marker. The PCR-generated SECs were subsequently cotransfected with pCMV-Luc into HEK 293 cells. Luciferase activity was measured 48 hours after transfection. Shown are ZsGreen-tagged (Panel A) and DsRedExpress-tagged (Panel B) SECs in cotrans-fected cells. The SECs effectively knock down luciferase expression by >85% (Panel C).
4. siRNA表达框架
siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点。它能够直接导入细胞进行表达而无需先克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序验证等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不到一天就可完成。因此，SECs是筛选siRNA的最简单有效的工具，可作为构建高效的体内转录载体进行RNAi研究的预实验，对不同宿主细胞优化筛选转录启动子和siRNA靶序列。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是PCR产物比较难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那可以解决很大问题。另外，不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现，可能会因此导致结果不理想。
