²操作过程
1.待冻存细胞悬液的制备
(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；
(2)将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；
(3)向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；
(4)按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；
(5)再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。
2.分级冷冻
(1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～8℃），约40min；
(2)接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-10℃～-20℃），约30～60min；
(3)将冻存管转入低温冰箱（-30℃），放置30min左右；
(4)然后将冻存管转移到超低温冰箱（-70℃～-80℃），过夜；
(5)最后将冻存管投入液氮保存。
3.记录
做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。
²冻存结果
如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。
²讨论
在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。
在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。
应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。
冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-196℃的液氮中取出冻存管，立即投入37～40℃温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。
¨玻璃化冻存方法
以下以人单核细胞为例说明这种细胞冻存方法（Takhashi et al. 1986）。
²主要材料
（1）冷冻保护液：为Hanks平衡盐溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用2 mol/L NaOH调节pH至7.4，现配现用。
（2）冻存管：SILASTIC玻璃小管，内径3mm，外径4.5mm；
（3）设备：液氮储存罐；
（4）待冻存细胞：人类外周血单核细胞。
²冻存过程
（1）用常规方法分离全血中单核细胞；
（2）在冰浴中预冷冷冻保护液；
（3）将装有单核细胞的离心管放置入盛有冰水的烧杯内（冰浴）；
（4）沿离心管壁缓慢滴加预冷的冷冻保护液。滴加过程为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加。2×107个细胞要滴加15ml冻存液。滴加的时间在15min左右。最终细胞密度要在1×106～1.5×106个细胞/ml，边滴加边轻轻晃动离心管；
（5）轻轻吹吸混匀细胞冷冻悬液；
（6）将细胞冷冻悬液分装于冻存管中。12cm长的冻存管装0.8ml细胞冷冻悬液；
（7）将冻存管两端以火焰封口；
（8）最后将冻存管直接投入液氮中保存。降温速度约为600℃/min。
