3 讨论
自60 年代,国外学者提出血迷路屏障的概念并被普遍接受以来,国内外一直采用形态学的方法和各种示踪技术,在活体动物上对血迷路屏障的通透特性进行了大量研究[2 ] ,由于受到在体( in vivo) 研究技术手段的限制,这些研究未能对血迷路屏障通透性的调控机制进行探索,更无法利用改变其通透性的方法开展对内耳疾病的防治研究,阻碍了学科进步[6 ] 。近年来, 国外学者用特殊的活体组织毛细血管分离技术,获取培养的单层融合内皮细胞,由此成功建立了研究不同器官血管内皮细胞通透性的体外模型,并被广泛应用。
Auerbach 等[7 ]通过研究证实,不同血管内皮细胞存在着明显的差异,这种差异既存在于动脉血管与静脉血管,大血管与小血管之间,也存在于中枢器官与外周器官微血管之间,例如与外周器官相比,中枢器官微血管内皮多为无窗型,细胞间形成紧密连接,胞饮较少,对辣根过氧化物酶等大分子物质不通透,因此,有学者将这类血管内皮称为屏障型内皮细胞。构成血脑屏障和血迷路屏障的脑及内耳微血管内皮细胞是典型的屏障型内皮,近年来由于脑微血管内皮的分离培离成功及体外模型的建立,使血脑屏障的通透性研究及药理学研究, 取得了许多重要进展。受此启发, Lamm[6 ] 于1994 年尝试将内耳软组织酶解后,用梯度离心的方法首次分离出了血管内皮细胞,但由于其中存在小动脉小静脉内皮的细胞沾染问题,消弱了其作为屏障型内皮的研究价值,因而未能得到认可及应用。
内耳结构复杂,微血管分布弥散且组织量很少,分离培离符合条件的微血管内皮有一定困难。本研究为了得到体外培养的耳蜗微血管内皮细胞,选择将毛细血管相对丰富的耳蜗血管纹进行微小组织块培养,并经过多次纯化处理,得到了相对纯净的微血管内皮细胞。做法是: ①熟练内耳显微解剖,自制的解剖工具细小尖锐且韧性好,便于显微解剖操作; ②为避免过多杂细胞的污染,将血管纹与螺旋韧带分开,将血管纹粘牢于培养皿底并切碎,利于毛细血管内皮向外生长; ③原代培养的培养液中胎牛血清浓度应不低于20 % ,当细胞集落足够大,细胞数足够多时才能首次传代; ④利用内皮细胞普遍具备消化时脱壁早、接种后贴壁快的特点进行多次纯化处理,可大大提高内皮细胞的纯净度, 但因为这样传代时会损失约1/ 2 的培养细胞,因而前三代细胞接种时数量应多一些,约(2～3) ×105/ ml ,以后每次接种时数量可保持在0. 5 ×105/ ml[4 ] 。
Ⅷ因子是内皮细胞的标志性抗原,本研究分离培养的细胞经免疫组化(S2P 法) 鉴定,超过95 %的细胞含有该抗原,而对照组则均为阴性,说明作者培养的细胞是基本纯净的内皮细胞[4 ] 。同时,该细胞连续传代 10 代,仍生长良好,形态未见明显变化,证明本研究在国内外首次分离培养成功的豚鼠内耳微血管内皮细胞,具有良好的稳定性,能为离体研究血迷路屏障的通透性,提供一理想的模型。
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参考文献:
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[2 ] Juhn S K, Rybak L P , Prado S. Nature of blood2labyrinth barrier in experi-mental conditions[J ] . Ann Otol Rhinol Laryngol ,1981 ,90 (2 Pt 1) :135 -141.
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[5 ] 司徒镇强,吴军正. 细胞培养[M] . 西安:世界图书出版公司西安分公司,1996. 63 - 83.
[6 ] Lamm K, Zaju G, Schacht J . Living isolated cells from inner ear vessels : anew approach for studying the regulation of cochlea microcirculation and vascular permeability[J ] . Hear Res ,1994 ,81 (122) :83 - 90.
[7 ] Auerbach R , Alby L , Morrissey L W, et al . Expression of organ2specific antigens on capillary endothelial cells[J ] . Microvasc Res , 1985 ,29 (3) :401 - 411.
