XTT克服了NBT所不能克服的许多问题，因此XTT看似为更合适的SOD检测法。但是，我们在用XTT法试验中，又遇到了几个新的问题。其中一个就是依赖于pH的灵敏度的变化（图2）。由NBT法所得的数据在pH8～10.2之间都是较为稳定的，但是在用XTT法时，如果降低了pH值会引起试验灵敏度的降低。因此，XTT法在pH8的灵敏度比NBT法要小。另一个问题是XTT的水溶性，XTT的水溶性在2 mM左右，并且需要一个加热过程来制备最佳XTT溶液(0.75 mM)。另外，图3中所示的背景OD值较高也是一个不容忽视的问题。因此，我们试着用不同的四唑盐来改进这个方法。
4.2 WST-1和WST-8
从1993年到1998年，Ishiyama博士和他的研究小组发现了好几种水溶性的四唑盐。由于这些四唑盐的水溶性为数十mM到数百mM，因此我们可以用它们来代替XTT进行SOD检测。在这个实验中，我们采用了WST-1和WST-8（其结构式如图1所示），WST-1和WST-8都是具有磺酸基的单四唑盐。首先，我们用标准的SOD来优化反应条件（图5）。
图5. 用WST-1（●）和WST-8（○）所得的抑制曲线
反应混合液包括2.5 ml磷酸缓冲液(A,pH8.0)或者50 mM碳酸盐缓冲液(B,pH 9.4;C,pH 10.2)以及0.1 ml 3 mM的EDTA，3 mM的黄嘌呤，58 mU/ml的黄嘌呤氧化酶，0.75 mM的WST，还有横坐标上所示浓度的SOD样品溶液。
WST-1和WST-8都显示了XTT法中出现的100%的抑制率，需要注意的是，在不同的pH下是否能得到几乎相同的IC50。这个结果显示了WST法可以解决在XTT和NBT法中所存在的问题，是检测SOD的理想的试剂。由于可以得到100%的抑制率，接下来我们就要用WST-1和WST-8来确定是否会像XTT试验中那样由葡糖-葡糖氧化酶反应生成甲臢（图6）。
图6. 葡糖氧化酶促葡糖氧化反应时WST与NBT还原反应的时间曲线
试验条件与图3中所用的相同，试验混合液含有0.1 mM NBT(■)，0.2 mM WST-1(●)或者0.2 mM WST-8(○)。需要在25℃下检测438(WST-1)，460（WST-8）或者560nm(NBT)的吸光度。
如同预期的一样，没有因葡糖-葡糖氧化酶反应而生成甲臢。而且随着WST浓度的增加，背景OD值并没有增加。因此，WST能够在背景较低的条件下检测SOD的活性。为了比较WST的灵敏度，我们将WST法所得的IC50与用XTT法和NBT法所得的进行比较（表1）。
| 表1: pH 10.2下各种四唑盐所得的IC50的比较 | |
|
四唑盐 |
IC50(ug/ml) |
|
WST-1 |
0.22 |
|
WST-8 |
0.75 |
|
XTT |
0.26 |
|
NBT |
0.55 |
