八、载体(vector)
载体的主要功能在基因选殖(cloning)，选殖的主要目的是分离、纯化及繁殖特定的基因。细菌性载体主要有质粒载体(plasmid vector)和噬菌体载体(phage vector)两种，我们这里所谈的以质粒载体为主。质粒载体的基本条件是：1.它们是复制体，能生生不息地被复制；2.它们有适当的标示基因，可供做转形株(transformant)和非转形株(non-transformant)的辨识；3.它们有另一组具有限制脢单切点的标示基因，可供插入外来基因并做为选殖株(clone)和非选殖株(non-clone)的辨识。此外它们的基因体要小，以便于操作和细胞转形。
利用质粒发展成载体第一个最成功的例子是pBR322(Bolivar et al, 1977)。它含有pMB1的复制原、pSC101的抗四环霉素(tetracycline)基因tet和Tn3(一种转位子)的抗青霉素(penicillin)基因bla。你可以把外来基因插在这两个抗药基因中的任何一个内，利用中断抗药基因的消失做选殖筛选，利用剩下的一个完整抗药基因做转形株筛选。因为pBR322的成功构筑，才使基因选殖有了长足的进展。
细胞转形(cell transformaiton)是基因选殖的重点工作之一。但细胞的转形率与外来DNA的大小成级数反比。以几万碱基对大小的DNA来转形大肠杆菌细胞几乎是不可能的。为了改善这种情况，结合了pBR322的载体特性和噬菌体λ(lambda)的壳蛋白包裹(packing)特性发展出cosmid pHC79 (Hohn and Collins 1980)。噬菌体λ的基因体由48,502个碱基对构成。它在宿主中的DNA复制产物是多个λ基因体相连的多元体(concatemers)。当噬菌体壳蛋白接近完成时才将λ基因多元体由一端「吸入」。当壳蛋白已经包裹了约相当于λ基因体75%的DNA(约36,000碱基对)时，一个特殊的λ DNA内切脢开始被活化并寻找适当的切点以便切开λ基因多元体完成包裹动作。如果壳蛋白已经包裹了约相当于λ基因体110%的DNA(约54,000碱基对)还没发现适当的切点时，包裹动作就会被放弃。这个「适当的切点」平时就在线状λ基因体DNA的两端，称为 cohesive sites (cos)。将噬菌体λ的cos切出植入pBR322中使新构筑的载体兼有质粒载体与可被视为λ基因体而被包入λ壳蛋白中的特性，可使30,000~50,000碱基对大小的DNA轻易地被选殖出来。因为它结合了λ cos site和plasmid，故称为cosmid。
载体pUCs(如pUC18、pUC19，Yanisch-Perron et al, 1980)则是利用pBR322做了选殖株筛选的进一步发展。它的特点是利用了呈色基因取代了pBR322中的一个抗药基因。大肠杆菌乳醣分解脢(β-galactosidase)可分解许多β-半乳醣化合物(β-galactoside)，其中也包括了X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)。X-gal呈淡黄色，分解后呈蓝色。大肠杆菌的乳醣分解脢有两个不寻常的特色：1.该酵素N-端的廿几个氨基酸和酵素活性无关，可以任意修改成连串的限制脢切点MCS (multiple cloning site)而不影响酵素活性；2. .该酵素基因如果被适当地分成两段(如前段lacZ’和后段lacZΔM15)，这两段基因的产物(α-chain和β-chain)尚能互补而具有酵素活性。载体pUCs利用了pBR322的基本骨架，以突变除去抗青霉素基因中的PstI切点，切除抗四环霉素基因并在该处加入具有MCS的lacZ’。至于后段的lacZΔM15则是利用F-质粒或噬菌体带入乳醣分解脢缺失型的大肠杆菌中。利用了这种载体与宿主的基因互补，pUCs改善了选殖株筛选的方式。何况在培养基中加乳醣分解脢基因的诱发物(inducer)IPTG(isopropyl-1-thio-β- D-galactopyranoside)，更可诱发乳醣分解脢大量表现。你只要看颜色就能鉴别选殖株与非选殖株。
载体pBluescripts(如pBluescript II KS(+)、pBluescript II KS(-)，(Alting-Mees and Short, 1989))则是利用pUCs做了DNA不同形式生产的进一步发展。它的特点是结合了pUCs的质粒载体特色与线状噬菌体的DNA复制特色，故称为phagemid。线状噬菌体(filamentous phage)是一群以线状单链DNA为基因体，以大量单一种类蛋白质(B蛋白)呈螺旋状包裹的极细长噬菌体。它们藉由性线毛的协助感染宿主，基因体进入宿主后会环状化(circulization)并复制互补链成为双绞链。DNA复制以rolling circle方式产生大量单链基因体DNA。基因体DNA被壳蛋白包裹后从宿主中「穿出」，并不会杀死宿主。将线状噬菌体f1的复制原切出植入质粒中并不会影响质粒的复制。但如果以适当的helper线状噬菌体感染含有phagemid的宿主时，phagemid就会产生大量的单链DNA。这些phagemid单链DNA也会被包入噬菌体壳蛋白中，并且包入的单链DNA与当初f1复制原在phagemid上的方向有关(+或-)。如此你就可以从宿主细胞中纯化phagemid双链DNA从事选殖等用途；从噬菌体中纯化单链DNA从事定序工作。
载体pETs(如pET12a、pET25b，Moffatt and Studier, 1986)则是结合了pBR322、pUCs或pBluescripts等的载体功能与噬菌体T7的基因调控。它的命名与外星人ET无关，而是结合了expression和T7 system。T7是溶菌型噬菌体。它在感染大肠杆菌后，首先利用宿主RNA聚合脢及核醣体制造出包含T7 RNA聚合脢及T7蛋白激脢(protein kinase)等噬菌体早期蛋白。T7蛋白激脢将宿主RNA聚合脢磷酸化使之失去活性；T7 RNA聚合脢马上接管宿主细胞中所有的转录工作。T7 RNA聚合脢是一条多胜链(single polypeptide)构成，只认识T7启动子不认得宿主启动子。载体pETs是将T7特有的启动子切出插入适当的载体中，利用这个启动子来启动欲表达的基因。至于T7 RNA聚合脢则是选殖入乳醣分解脢基因启动子的后方，以λ噬菌体带入适当的宿主细胞内。当我们在培养基中加入IPTG诱发T7 RNA聚合脢的大量制造时，大量的T7 RNA聚合脢就转而大量地转录我们欲表达的基因。利用这种方式可以大量生产选殖在T7启动子后方的基因产物。生产量竟然能达到大肠杆菌蛋白质总量的1/10呢！这种载体称为表达载体(expression vectors)。在生理学、遗传学及研究经验上，大肠杆菌及它的质粒和噬菌体都是我们最熟悉的。分子生物学及基因选殖也是从大肠杆菌开始发迹。基于这些原因，无论我们选殖动、植物基因或其它原核基因时，所考虑的第一个中间宿主总是大肠杆菌。在我们已经完成大肠杆菌中的基因选殖、鉴定及定序等工作后，选殖的基因总要送回原来的生物细胞或生物体中才有意义。然而绝大多数的大肠杆菌载体是无法在其它生物细胞中生存的。为了克服这种困难，于是人们纷纷切下包括动、植物及其它各种原核生物的质粒复制原、病毒复制原、染色体复制原，甚至染色体的部分DNA，将之插入大肠杆菌载体中。再配上其它适当的启动子，如此构筑成的载体不但可以用来转形大肠杆菌以外的细胞并且可以在这些细胞中做适当的基因表达。这一类能穿梭于两种不同生物细胞之间的载体便称为穿梭载体(shuttle vectors)。
九、载体的适当利用
载体的种类繁多，厂商能够提供的及研究室或研究个人能够提供不计其数。当你需要利用载体时，你必须清楚你的目的。载体与宿主的搭配也非常重要，必须了解它们的特性与基因标示才能得心应手的运用。最后，也提供一些常用的质粒、载体与宿主来源：
机构：
ATCC： http://www.atcc.org
CABRI： http://www.cabri.org
CGSC/Yale University： http://cgsc.biology.yale.edu
DSMZ： http://www.dsmz.de
National Institute of Genetics/Japan： http://shigen.lab.nig.ac.jp
食工所生物资源保存及研究中心： http://www.ccrc.firdi.org.tw/ch-home.htm
厂商：
Clontech： http://www.clontech.com
Fermentas： http://www.fermentas.com
New England Biolabs： http://www.neb.com
Novagen： http://www.novagen.com
Promega： http://www.promega.com
Roche： http://www.roche-applied-science.com
Stratagen： http://www.stratagene.com
