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质粒与载体
作者:杜 镇… 来源:中央研究院植物研究所 时间:2007-11-5


    2. Iterons与repA:

    质粒pSC101的复制除了需要宿主供应的酵素外尚需要RepA蛋白。RepA是pSC101的基因产物,在功能上他扮演了复制的活化因子(activator)与自我抑制因子(autorepressor)。RepA基因位于pSC101复制原的前方,其转录方向和pSC101复制方向正好相反。在RepA基因的启动子和pSC101复制原中有好几个顺向和反向的重复DNA短段,长约18~22个碱基对,称为iteron(s)。RepA会粘黏在iteron上。质粒在低浓度(低套数)时,产生低浓度的RepA促进了质粒的复制;质粒在高浓度(高套数)时,产生大量的RepA粘黏在复制原和RepA基因的启动子上抑制质粒的复制。于是,RepA和iterons的相互作用决定了pSC101的套数。

    五、质粒的不共容性(incompatibility)

    有时我们会想知道一个细菌细胞中会同时出现多少种质粒呢(种类非个数,个数是指套数)?这个问题倒没有一个确切的答案。由自然环境分离的细菌细胞中含有一至三种质粒是常见的,有时多至七、八种也不令人意外。质粒的种类虽多,但并非所有的质粒都能同时在同一个宿主细胞中生存。有一些质粒在同一个宿主细胞中会发生相互排斥的现象,我们称这种现象为质粒的不共容性(incompatibility)。质粒的不共容与他们的复制机制与套数调控有关。当两种复制与套数调控机制毫不相干的质粒在同一个细胞中生存时,它们各自复制再各自分配到不同的子细胞中,不会发生干扰。当两种复制机制与套数调控相关或甚至相同的质粒在同一个细胞中生存时,复制与套数调控机制就会把它们看做同一种质粒而将他们的套数控制在一定的数目内。因为细胞分裂时质粒在子细胞中分配不均匀的缘故,经过几十次的细胞分裂后你只可能在特定的子细胞中找到其中一种质粒。根据这种不共容性,质粒被分为许多不共容群(incompatibility group,简称为inc),譬如RP4属于incP;RSF1010属于incQ而pSa属于incW等。如果你在实验中发现有一种质粒竟然属于两个不同的不共容群或有不共容不完全的现象。别惊慌!那是有可能发生的。在革兰氏阴性菌中,大肠杆菌与假单胞杆菌的质粒分类是做的比较清楚的。

    六、质粒的宿主范围(host range)

    质粒间的宿主范围有很大的差异。能在多种不同菌属的细胞中生存的质粒称为泛宿主性质粒,如RP4和RSF1010;只能在单一或极为相近的宿主中生存的质粒称为狭宿主性质粒,如F-质粒和ColE1。质粒的宿主范围与其复制所需要的条件和质粒本身所携带的基因有关。如果一个质粒携有与本身复制有关的基因,而这些基因的启动子又是最容易启动的,那它对宿主的需求自然很少,它的宿主范围当然很广。如RP4在几乎所有的革兰氏阴性菌中都能生存。相反的,一个对宿主需求很多的质粒,对宿主的依赖自然很强,它的宿主范围当然很窄。如F-质粒只能在大肠杆菌中生存。

    七、质粒的结合生殖(conjugation)

    有的质粒具有在细菌细胞间进行结合生殖的能力,这些质粒称为结合质粒(conjugative plasmids)或自动转移质粒(self-transmissible plasmids)。质粒的结合生殖过程包含了细菌细胞间的结合与质粒的DNA复制。与质粒结合生殖有关的基因很多,其中包括主持其事的基因和许多调控结合生殖的基因。这些基因在不同的质粒系统中各有其名,但多数被命名为tra(Transfer)或mob(mobility),如traA、tra、mobA、mobB等等。一个结合质粒至少要具有下列三个基本条件:1.产生性线毛(sex pili)的能力、2.具有转移原oriT(origin of transfer)及3.能辨认oriT的特殊DNA内切脢(DNA endonuclease)。
    结合质粒有产生线毛蛋白(pilin)的基因,线毛蛋白产生后组成性线毛。虽然性线毛因来源质粒不同而有F-线毛(来自F-质粒)、R-线毛(来自R-质粒)等之分,但在功能上它们的作用都是用来刺激细菌细胞使之结合。含有结合质粒能产生性线毛的细菌细胞称为雄型(male type)或正型(+ type);不含结合质粒无性线毛的细菌细胞称为雌型(female type)或负型(- type)。结合生殖时正型称为授株(donor);负型称为受株(recipient)。结合生殖的结果使负型变为新的正型,此时新的正型称为transconjugant(有些情况称为exoconjugant)。
    质粒在结合生殖时要靠特殊的DNA内切脢将质粒DNA中的一股在特定的地方切成单链,然后将切成单链的一股DNA经由两个细胞的结合处传送到受株中,同时以rolling circle方式完成各股DNA的复制。质粒DNA中被切开的特定的地方就是oriT或称为bom(basis of mobility)、nic(nick site),它们具有一定的DNA序列。切oriT的DNA内切脢有时称为nickase,它是tra基因中之一的产物。每一类的oriT均有它特定的DNA内切脢,并且内切脢应该切oriT处的哪一条链及哪两个碱基之间也是一定的。
    非结合质粒中有些因为具有oriT或bom,所以可以经由具tra基因的helper质粒协助而被传送。可被传送的非结合质粒称为可移动质粒(mobilizable plasmids),pBR322就属于这个类型;不可被传送者称为不可移动质粒(non-mobilizable plasmids),RSF1010属这一型。可移动质粒与helper质粒的搭配使用在基因转殖上是常被利用的技术。
    结合质粒F上有若干个与大肠杆菌染色体上相同的转位子。在偶然的状况下因为相同DNA序列的转位子发生同源重组(homologous recombination),结果使F-质粒与染色体DNA融成一体。这种授株被称为Hfr(high frequency of recombination)。当Hfr的F-质粒做结合生殖时,整个与其黏合的大肠杆菌染色体会依序地被传送到受株中。大肠杆菌的基因图谱就是靠这种方式完成的。你也可以利用泛宿主性结合质粒在其它菌种中做类似的工作,但因DNA定序技术的高度发展已使得这类工作显得费时与不够精确了。

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