2.3 生物学特性检测
2.3.1 ALP检测 经改良钙钴法染色后,在使用条件培养基的传代细胞培养组中,大部分染色的骨髓基质细胞呈阳性反应,胞浆中可见浅棕色至棕黑色的细小颗粒,大多角形细胞呈强阳性,有些融合成块状,而梭形细胞染色略弱。4张玻片,每片随机取2个视野,采用网格计数法,计算平均ALP阳性百分率为68%。使用完全培养基的传代细胞ALP染色大部分阴性,少数弱阳性。
2.3.2 细胞形成钙结节能力的检测 使用条件培养基传代培养2周的细胞呈集落生长后开始形成钙结节,随着培养时间的延长钙结节逐渐增多,经Von kossa’s染色呈阳性。
3 讨 论
1995年，Crane GM[2]系统提出了骨组织工程的概念、研究方法及发展应用前景。骨组织工程要求其种子细胞应具备较强的增殖能力和良好的成骨功能。目前骨种子细胞的来源主要有骨、骨膜、骨髓、骨外组织和早期胚胎。而骨髓基质干细胞(BMSc)是间充质来源的干细胞，通常也被称为骨髓间充质干细胞[3]，因其干细胞体外培养具较强的传代繁殖力，且有取材容易和对机体损伤小的特点，因此在骨组织工程中有广阔的应用前景。
目前已经在动物实验中建立了一些体外培养的方法，但由于BMSc具有多分化潜能而且成骨量少，目前对BMSc最佳诱导分化条件尚未确定，因此，对于成人骨髓基质细胞的体外培养及诱导分化仍然存在许多问题。本研究曾在预实验中采用全骨髓法及离心法分别对兔、鼠、人的BMSc进行培养，均能获得生物性状良好的成骨细胞进行培养，发现两种方法在获得贴壁细胞的时间及时间无明显差异，而离心法操作较全骨髓法复杂，污染机会多，因此认为全骨髓法较离心法简单易行，操作易于规范，重复性好，适合用于建立成骨细胞的研究平台。
本实验中还发现，选用一次性培养瓶的，贴壁细胞数量较玻璃培养瓶者多，而贴壁时间亦早，一次性培养瓶中，一般24～48h即可观察到贴壁的细胞呈成纤维细胞样外形，而玻璃瓶中则平均要晚24h左右。具体原因尚不清楚，考虑可能是塑料的表面更粗燥，适合细胞贴壁。原代培育的细胞在4～5d时开始出现梭形、三角形及多角形等形态，1周左右可以观察到细胞呈集落样生长，周围有许多突起，核大而明显，成卵圆形，1～3个核仁，胞质丰富，并可见较多核分裂象，汇合时间约为2周。在细胞培养过程中，首次换液应采用半量换液，并尽量少晃动培养瓶，以免刚贴壁的细胞脱壁。换液最好使用37℃水浴后的培养基，本实验过程中，曾发生用4℃培养基换液后大量细胞脱壁的现象。传代培养，细胞生长较原代培养快，大约10d可长满瓶底，在条件培养基中细胞无接触抑制现象，可重叠生长，最后形成钙结节。传代时，使用0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA应根据镜下观察来决定消化时间，消化时间与胰蛋白酶浓度、消化液的温度、消化液的量均有关。一般是观察到贴壁细胞开始变圆，即可终止消化，吹打后传代。
本实验采用Kadiyala 等[4]描述的成骨诱导方法,即用地塞米松、维生素C 和β-甘油磷酸钠联合诱导。这是由于地塞米松不仅能促进成骨细胞分化成熟，诱导成骨，而且具有调节成骨样细胞合成胰岛素样生长因子和促进胶原合成的作用，刺激其ALP活性；β-甘油磷酸钠提供磷离子作为ALP作用的底物，诱导和激活ALP，促进有机磷向无机磷转化，加速钙盐沉着。抗坏血酸能促进体外培养细胞合成胶原, 形成钙化, 且能调节ALP 活性,影响其合成。本实验参考任高宏等[5]的方法，普通培养基中加入10-8 mol/l地塞米松、10mmol/lβ-甘油磷酸钠、50mg/l维生素C，经形态学观察和组织学观察，得到具有典型生物学特性的成骨细胞。
骨髓取材容易，对机体损伤小，是较理想的骨组织工程种子细胞的来源。本实验对成人骨髓基质细胞进行体外培养，在较短时间内获得较多较高纯度的自体成骨细胞,经传代培养仍具有与成骨细胞相似的形态与生物学特性,且周期短、重复性好，可以作为进一步研究成骨细胞及骨组织工程的技术平台。
参考文献
〔1〕 Lennon D P,Haynesworth S E,Young K G et al.A chemically defined medium supports in vitro proliferation and matains the osteochondral potential of rat marrow derived mesenchymal stem cells〔J〕.Exp Cell Res,1995,219:211
〔2〕 Crane G M,Lshaug S L,Mikos A G, et al.Bone tissue engineering〔J〕.Nature Medicine,1995,1(12):1322
〔3〕 Prockop D J.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissue〔J〕.Science,1997,276:71
〔4〕 Kadiyala S , Young R G, Thiede MA. Culture expanded canine mesenchy2mal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro〔J 〕 .Cell Transplant ,1997 ,6 (2) :125 - 134.
〔5〕 任高宏，裴国献，王钢，等.成人骨髓成骨细胞体外培养[J].骨与关节创伤杂志,2003,18(2):118-121
作者简介 王振斌（1972- ），男，汉族，山东惠民县人，硕士在读，研究方向：创伤修复与重建。
