二、组织培养分离流感病毒
流感监测最主要的目的是及时发现并分离到有意义的流感病毒新变种，尤其大流行株，用于诊断试剂的制备、疫苗的生产及疫情预报。组织培养技术是分离，诊断流感病毒最常用和最可靠的方法之一。
人流感病毒最初是通过雪貂分离出，但雪貂繁殖慢，量少，价钱昂贵并难饲养，故无法加以广泛应用。上世纪30年代中开始，多用鸡胚来分离流感病毒。
近来由于PCR技术突习猛进地发展，发现了通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与原始标本的有所不同，而通过MDCK细胞分离出的，其抗原性与原始标本的相似。近来由于“O”相毒株的重现，MDCK等一些细胞对“O”相毒株的敏感性大大超出鸡胚的敏感性。因此，MDCK等一些细胞已成为各流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。
由于MDCK等一些传代细胞属肿瘤细胞系，用其分离的病毒不能用于疫苗制备，故要求进行流感病毒分离时，同时采用鸡胚和MDCK细胞。
（一）MDCK细胞分离流感病毒 1、实验材料：
MDCK细胞（最好是早代的）
Eagle氏培养液（日本产的含谷氨酰胺的以抽滤为好）
Hank氏溶液
0.25%胰酶和Versene消化液
双抗(青、链霉素)或庆大霉素和抗真菌素
胎牛或小牛血清
5.6%或7.5%的NaHCO3.
（1）细胞生长液配制
90ml Eagle’s液+含终浓度为100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素+10ml小牛血清+2ml 5.6%NaHCO3 PH调至 7.2-7.4。
（2）细胞维持液配制:
同生长液，但不含胎牛或小牛血清，而含终浓度为2–3ug/ml胰酶，用前用NaHC03将PH调至中性或偏碱。维持液的作用是使细胞停止繁殖，但仍保持代谢。
2、MDCK细胞传代
（1）先把需用的Eagle’s和Versene放37℃水浴预温，其它试剂不得放入。
（2）已成片的MDCK细胞，将其生长液倒掉。用Versene洗2遍。
（3）把Versene与0.25%胰酶按7∶1比例配成消化液。
（4）置37℃恒温箱5—10min，当细胞变圆，细胞与细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成片，表明消化时间未到。
（5）倒掉消化液，瓶内留少许流体，再放37℃ 2’–3’，取出手上轻轻拍打几下，这时可加已配好的生长液，稍加吹打即可。一般情况下，1瓶细胞传3瓶 ，每2-3天需传一代。
3、MDCK细胞保存及复苏
MDCK细胞对流感病毒的敏感性随其代数增加而下降，故各实验室应液氮冻存代数较低的细胞作为种子。一般保存液为含10%二甲基亚砜和90%小牛血清。
（1）MDCK细胞保存：将单层细胞消化分散成为单细胞，加入0.9ml小牛血清和0.1ml二甲基亚砜混合保存液，每瓶加1ml保存液，缓慢冻存：先放4℃2h，转放–70℃4h，再转放液氮中长期保存。
（2）MDCK细胞复苏：细胞冻存管从液氮罐取出后，速放37℃水浴溶化，1500rpm/分离心1分钟，弃上清、沉渣加入若干ml培养液，混匀后加入细胞培养瓶中，置37℃二氧化碳温箱培养。
4、MDCK细胞对流感病毒敏感性测试
MDCK细胞对病毒的敏感性随其代数增加而下降。故MDCK细胞在实验室传20代以上时，一般需测试一下其对流感病毒的敏感性。其具体测试法：选一株对MDCK细胞较敏感的流感病毒株。在同一条件下，用早代与要测试的MDCK细胞对其进行TCLD50测定。如果测试的TCLD50比早代的低2个或以上Log,表明其对病毒的敏感性已下降，不应再加以使用 。
