生物秀首页 新闻前沿 产业资讯 实验技术 仪器教程 生物考研 资源下载 生物人 物秀商城 生物论坛 图片 专业 博客 易生物 视频动画
生命科学实验中心
导航: 生物秀 > 实验 > DNA 实验 > 理论知识 > 正文
  • 倾力提供最优!
  • 生物秀实验频道
核酸抽提的基础现状
作者:佚名 来源:丁香园 时间:2007-10-26

    12、QC 的概念

    QC 概念远没有QT 概念深入人心。最高境界的产品追求的是免检,或者是Trouble-free。另外,现在的许多产品也是不允许QT 的 (因为是一次性的),因此就只能靠QC 来保证质量了。QC 是将精力集中在过程中:原料、操作等。只要严格按照标准去做,最终的结果就有保证。事实上,很多实验人员是不做检测而直接将抽提好的核酸用于后续实验的;他们之所以可以这么做,是因为他们有意无意之中非常的注意QC。也有不少人,尤其是新手,Pay no attention to QC,只知道最后的QT。一旦发现问题,就去逆推原因;但因为过程中所出现的现象根本就没有注意,几乎不可能准确找出真正的原因的。如果QC 做得好,最后的QT 是否全部做/部分做/完全不做,取决于时间、经验、后续实验的成本等因素。

    13、EP 管的问题

    几乎没有人会认为EP 管的质量会与核酸抽提的操作有关,与某些现象(如核酸在-20℃ 保存一天后发生了降解)有关系,但事实是,EP 管的质量的确与核酸抽提的质量以及核酸保存时的稳定性有关。

    硅化可以提供最高质量的EP 管,使某些奇怪的现象消失或者大大减轻。最糟糕的EP 管对液体有较强的吸附力,在倾倒液体时残留多,核酸在管中保存的过程中会发生变性。这样的管子是很有市场的,因为便宜;而正因为便宜,其材料总是不令人放心的。

    我个人认为,只有硅化过的EP 管,才可能按照标准操作获得满意的结果。否则,某些操作步骤必须调整,才可以获得稳定的质量。

    14、核酸抽提中的温度问题

    核酸抽提中的温度问题,也是一个值得关注的问题。首先要明确的一点是,任何一个温度条件,对某些方面有利,同时也一定会有不利的一面。如沉淀,低温操作会提高得率,但也会增加杂质的残留。任何一步操作该用什么温度为好,应该是利弊权衡的结果。基本上,除了一些特殊的步骤,如消化等外,用室温是最好的选择。那些认为“低温操作可以防止降解”之类的理由,并没有多少可信度的。

    15、如何阅读操作手册

    拿到操作手册后,要倒着阅读:先阅读问题解答,再看操作步骤下面的说明,再看操作步骤。问题解答是别人在使用过程中曾经碰到过的问题集锦,操作步骤下面的说明是商家的警告。没有一个商家会将他的操作步骤写得非常复杂,因为这是满足使用人员习惯的结果。一句话,PS 和By the Way 之类的话中含有真正的有用素材。

    16、其它

    核酸抽提的每一步操作,都是利弊权衡的结果。消化要彻底,时间就会长;PC 抽提时多取上清,得率会提高,但增加了蛋白质污染的风险;沉淀使用低温且时间长,得率会提高,但增加了杂质污染的风险 … 不足详列。总之,核酸抽提是艺术,可以根据自己的样品及当时的情况,对操作步骤进行适当的优化。

    17、实验的思维

    核酸抽提的成功,就是每一步都没有失败。这不是玩文字游戏,而是告诉你做实验的良好思维。就如同小学基础没有打好,早晚会发现大问题一样,做实验决不要以成功为喜悦,以失败为痛苦。要保证实验成功,绝对不能有“这个操作应该没有问题”,“用这个可能不会有问题”之类的侥幸心理。去掉任何一个可能使实验失败的因素,这才是实验该有的出发点。用这样的出发点,实验几乎没有不成功的,所以说,实验成功没有什么快乐;实验的快乐来自于:发现自认为不会导致失败的某因素实际会导致实验的失败。学到了这样的知识,才有快乐的理由。

    18、EB 在NA 抽提中的运用

    EB 在NA 抽提中的应用,用于电泳,人皆尽知;用于gDNA 抽提时提高蛋白质与gDNA 的分离效率,却似乎没有人再考虑了,因为大家都怕使用EB。在 NA 抽提中涉及到EB 的另外一大类,就是胶回收操作了;EB 在胶回收中扮演的角色,就不完全是正面的。

    如果NA 与EB 充分接触,EB 就会以每隔数个碱基的频率均匀地插入NA 之中。EB 的这种插入,无疑更可能破坏核酸双链的稳定性,使核酸由双链变成单链的压力增加。如果核酸比较短,而错配又多(错配的后果之一也是核酸容易由双链变成单链),EB 的插入将更容易导致的出现。这个观点有如下的实验报告佐证:有相当部分的PCR 产物胶回收实验,都报告说回收后的电泳结果是:目的条带变淡或者消失,同时出现了一条小的原来不存在的条带。

    坛中曾有文描述他做胶回收的程序:两边加Marker,中间加产物;电泳过程不含EB。电泳结束后,纵向割下Marker 条带用EB 染色后,放回胶原来的位置。开紫外,根据Marker 的位置割下目的条带,再回收。这是个笨办法,但这样使用的人一定是聪明人。

    19、核酸的保存

    基本上,核酸在保存中的稳定性,与温度成反比,与浓度成正比。虽然也有部分实验人员发现,-20℃保存的DNA 比-70℃保存的稳定,我却宁可认为这是个例。

    如果温度合适,保存中核酸发生降解或者消失,首要原因是酶残留导致的酶解,第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解。还有一个不为人重视的,就是EP 管对核酸的影响。首先一定要坚信一点,那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应,达到某种均衡。EP 管的材质,首先可能媳妇核酸,其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化,如变性。在核酸的浓度比较高时,这个现象可能观察不到;当核酸浓度很低时,则比较明显了。在低浓度的核酸中加入Geletin、Glycogen、BSA 可以稳定核酸,虽然已经为实验所证明,但许多实验人员并没有将该建议当回事。

    现在制造EP 管的材料远多于过去。这些新出现的材料,在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯PP 材质要好许多,但其化学特征,尤其是对核酸稳定性的可能影响,远没有研究透彻。正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要求一样,其负面产物可能是,抽提的质粒电泳的构型越来越多:除了原来的三种带型外,还可能出现denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型。

    上一页  [1] [2] [3] [4] 

关于〖核酸抽提的基础现状〗的最新评论
昵称:      评分: 1分 2分 3分 4分 5分
内容:
生物秀实验频道
设为首页 | 加入收藏 | 关于我们 | 战略伙伴 | 友情链接 | 法律声明 | 广告服务 | 联系我们 | 网站地图
Copyright © 2003-2008 生物秀 (中国·生物秀科技) 版权所有 信产部备案:鲁ICP备05001831号
客服信箱:info@bbioo.com  客服电话:15800302289  客服QQ:254857951
www.bbioo.com All Rights Reserved.