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怎样选择凝胶
作者:佚名 来源:生物秀 时间:2007-9-29

    13.纯化------核酸、病毒

    核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子,和质粒DNA一样,可用分离大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白,再配合离子交换如Mono Q、SOURCE Q分离核酸。

    14.纯化------寡核苷酸

    寡酸苷酸多应用在反义(anti-sense)DNA、RNA测序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以阴离子交换的Mono Q或快速低反压的SOURCE Q在PH12下可除副产物,并避免凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层析,可用做大量制备。不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。

    15.脱盐、小分子去除

    使用凝胶过滤介质Sephadex G10,G15,G25,G50等去除小分子,效率高,处理量可达床体积30%。只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液,就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子,简单直接。由于只是去除小分子,柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分钟至半小时完成。Sephadex G25系列介质专为蛋白质脱盐而设计,预装柱HiTrap Desalting(5ml)可用针筒操作。HiPrep Desalting(26ml)可在数分钟为多至10ml样品脱盐。

    16.疫苗纯化

    使用凝胶过滤介质Sepharose 4FF纯化疫苗,去除培养基中的杂蛋白,处理量可大于床体积10%。柱高一般40-70cm,整个过程约半至一小时。目前使用此法生产的疫苗品种有乙肝、狂犬、出血热、流感、肺结核、小儿麻痹疫苗等。分子量较小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR,如甲肝疫苗等。

    17.抗生素聚合物分析

    中国药典从2000年版起要求抗生素头孢曲松钠需要找出聚合物占产品的白分比,规定使用Sephadex G10凝胶过滤法测定。

    18.纯化-基因治疗用病毒载体
    SORRCE 15Q

    19.纯化-基因治疗用质粒
    Q Sepharose XL,SOURCE 15Q,STREAMLINE Q,Sephacryl S500,Plasmidselect 在下游纯化中,可应用不同层析技术在纯化生物分子的同时,去除各种污染物。
    1.去除——内毒素
    内毒素又称热原。含脂肪A、糖类和蛋白,是带负电的复合大分子。
    内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性。但在高盐下会凝集,无法上疏水层析。利用疏水层析试验盒(17-1349-01)可选择结合目标蛋白的介质而去除内毒素。
    内毒素与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合。可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除。
    利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶联内毒素底物如LAL,PMB,自动成亲合层析介质结合内毒素。内毒素经常是多聚体,凝胶过滤层析可有效地将之去除。
    2.去除——蛋白中的核酸
    大量核酸增加样本黏度,令区带扩张,反压增加,降低分辨率和流速。药审和食检对核酸含量也有严格限制。


    胞内表达蛋白的核酸问题尤其严重。核酸带阴电荷,在初步纯化时利用阳离子交换介质如STREAMLINESP,SP Sepharose Big Beads,SP或CM Sepharose FF,SP SepharoseXL结合目标蛋白,可除去大量核酸。
    核酸在高盐下会和蛋白解离,疏水层析介质很适合用来结合目标蛋白,在纯化蛋白的同时去除核酸。
    利用核酸酶将核酸切成小片断,用凝胶过滤做精细纯化时便很容易去除了。

    3.去除——病毒和微生物
    病毒和微生物可成为病原,应尽量减除。结合不同层析技术,使用注射用水,用NaOH定期进行仪器和凝胶的在位消毒和在位清洗,皆可避免污染物增加。
    病毒大都有脂外壳。可用与目标蛋白电荷相反的S/D(solvent/detergent)处理,使病毒失活,如Triton和Tween。再用适当的离子交换介质如CM Sepharose FF结合目标蛋白,去除S/D。
    其它污染物可以改变pH和离子强度使其从目标分子中解离或失活,凝胶过滤介质Superdex及多种吸附性介质,SOURCE都是很好的精细纯化介质,可去除多种微量污染物。

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