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怎样选择凝胶
作者:佚名 来源:生物秀 时间:2007-9-29

    *疏水层析Phenyl Sepharose HP亦很适合纯化IgG。宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。
    *纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG,再进一步获取IgG抗原。
    *HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM,结合量达5mg IgM。HiTrap IgY是专门用来纯化IgY,结合量达100mg纯IgY。

    8.纯化------重组蛋白

    重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物,扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。Amersham biosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。
    一] GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达,然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和层析纯化,再利用凝血酶或因子Xa切开。
    2. 蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达,以IgG Sepharose 6 FF纯化。
    二] 含组氨酸标记(Histidine-tagged)的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2 金属,在一般或变性条件(8M尿素)下透过组氨酸螯合融合蛋白。HisTrap试剂盒提供整套His-Tag蛋白的纯化方法。

    9.纯化------包涵体蛋白

    包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中。高化学稳定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白需要复性至蛋白的天然构象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高,复性效果越好。SOURCE 30 RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品,并可以1MnaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白,复性回收率明显提高。

    10.包涵体蛋白固相复性

    *近年许多文献报导将包涵体蛋白在变性条件下固定(吸附)在层析介质上,一般用各种Sepharose FF离子交换层析介质。去除变性剂后,蛋白在介质上成功复性,再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白质聚体的形成,所以复性得率更高,而且无需大量稀释样品,并将复性和初纯化合二为一,大大节省时间及提高回收率。
    *固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组氨酸融合蛋白;以HiTrap Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用,比一般试剂盒更方便、耐用。

    11.纯化------中草药有效成分

    中药的化学成分极其复杂。传统中药多是煎熬后服用,有效成份多较为亲水,包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合性地利用多种层析方法。如离子交换、分子筛、反相层析,更容易分离到单一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛功能,例:如用甲醇分离黄酮甙,三糖甙先被洗下来,二糖甙其次,单糖甙随后,最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂,广泛用于各种天然产物的分离,包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内脂、萜类、甾类等。
    *生物碱在酸性缓冲液中带正电,成为盐,HiTrap SP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常近似的生物碱。相反,黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中,在HiTrap Q阴离子交换柱上分离效果良好。
    *一般多糖纯化大多使用分子筛如Sephadex,Sephacryl。若分子量在600KD以下,并需更高分辨率,可选择新一代的Superdex。一般植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组份纯品。另外,多糖药物需去除可引起过敏的蛋白质,传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需反复数十次。阴阳离子交换法可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。SOURCE5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。由于中药的成分非常复杂,SOURCE反相层析可用范围为PH1-14 ,并可用1M NaOH,1M HCL清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗,寿命也更长。

    12.纯化------肽类

    肽类的来源有天然萃取,合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降解,但可从有机溶剂或促溶剂中复性,所以多以高选择性的反相层析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或离子交换Minibeads、Monobeads作纯化。Superdex Peptide HR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱,能配合反相层析做出更精美的肽图。肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex 30 PG。

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