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Western-Blot操作流程
作者:佚名 来源:生物秀 时间:2007-9-29

    试剂配制

    (一)母液
    1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g
    蒸馏水 200ml
    溶解后,用浓盐酸调pH至所需点(见下所示),最后用蒸馏水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。 PH HCl
    7.4 约17ml
    7.5 约16m
    7.6 约15ml
    8.0 约10ml
    1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g
    异丙醇 100ml
    溶解后,分装于1.5ml离心管中,-20℃保存。
    0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4(MW119.98) 12g
    蒸馏水至 500ml
    溶解后,高压灭菌,室温保存。
    0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO·12H2O(MW 358.14) 71.6g
    蒸馏水至 1000ml
    溶解后,高压灭菌,室温保存。
    10%SDS SDS 10g
    蒸馏水至 100ml
    50℃水浴下溶解,室温保存。如在长期保存中出现沉淀,水浴溶化后,仍可使用。
    10%过硫酸胺(AP) 过硫酸胺 0.1g
    超纯水 1.0ml
    溶解后,4℃保存,保存时间为1周。
    (可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中,一次性多装几管,使用时加入超纯水即可)
    1.5mol/L Tris·HCl(pH8.8) Tris (MW121.14) 45.43g
    超纯水 200ml
    溶解后,用浓盐酸调pH至8.8,最后用超纯水定容至250ml,室温下保存。
    0.5mol/L Tris·HCl(pH6.8) Tris (MW121.14) 15.14g
    超纯水 200ml
    溶解后,用浓盐酸调pH至6.8,最后用超纯水定容至250ml,室温下保存。
    40%Acr/Bic(37.5:1) 丙稀酰胺(Acr) 37.5g
    甲叉双丙稀酰胺(Bic) 1g
    超纯水至 100ml
    溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
    20%Tween20 Tween20 20ml
    蒸馏水至 100ml
    混匀后4℃保存。
    (二)使用液
    单去污剂裂解液(PMSF): 1mol/L Tris·HCl(pH8.0) 2.5ml
    NaCl 0.438g
    TritonX-100 0.5ml
    蒸馏水至 50ml
    混匀后4℃保存。使用时,加入PMSF至终浓度为100μg/ml(0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl)。
    (一般实际用的比较多的其实是RIPA裂解配方:50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。至于其中每个要加多少量那就自己去算吧,因为本人已经算好的配方表无意间弄丢了)
    0.01mol/L PBS( pH 7.2-7.4) 0.2 mol/L NaH2PO 19ml
    0.2 mol/L NaHPO4 81ml
    NaCl 17g
    蒸馏水至 2000ml
    (如果用TBST进行洗膜的话,其实PBS用得很少,大可不必自己配制,向试剂公司购买20×的PBS浓缩液即可,500ml的浓缩液不到50元,很方便)
    G250考马斯亮蓝溶液(蛋白定量专用) 考马斯亮蓝G250 100mg
    95%乙醇 50ml
    磷酸 100ml
    蒸馏水至 1000ml
    配制时,先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料,再加入磷酸和水,混匀后,用滤纸过滤,4℃保存。
    0.15 mol/L NaCl NaCl(MW58.44) 0.877g
    蒸馏水至 100 ml
    高温灭菌后,室温保存。
    100mg/ml 牛血清白蛋白(BSA) BSA 0.1g
    0.15 mol/L NaCl 1ml
    溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时,用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml,-20℃保存。
    ……………………

    全文下载:http://www.bbioo.com/Soft/2007/1555.htm

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